Development of a screening procedure for muscle hypertrophy/atrophy related molecules by using myotube cells and comprehensive gene knockdown

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2022年度は以下の2点について研究を進めた。１　骨格筋分化におけるNsmafの役割neutral sphingomyelinase activation associated factor (Nsmaf)は中性スフィンゴミエリナーゼを活性化することでセラミド合成を調節する因子と報告されている。またNsmafはTNFαのシグナル伝達経路を調節する因子としても知られている。本年度はNsmafがTNFαシグナルに関与する直接的な証拠を得るためにまず培地中のTNFα濃度を測定した。その結果、筋分化前および筋分化後にTNFαが培養上清中に産生されることを確認できた。特に分化培地中に大量のTNFαが存在することが確認できた。さらにNsmafの過剰発現プラスミドを設計しSV40プロモーターにてNsmafを過剰発現させることでｍRNA量にて10倍以上の発現誘導に成功した。ところが筋分化にはほとんど影響しなかった。以上からNsmafはTNFαシグナルにおけるゲートキーパーとして分化を制御する可能性が示唆された。２　Foxo遺伝子群における探索的ＲＮＡ干渉当初は筋萎縮因子として位置づけられたFoxoタンパク質群は現在では多彩な機能を持つこと解明されつつあり探索的ＲＮＡ干渉に最適と位置付けた。そこでFoxo遺伝子群の探索的ＲＮＡ干渉を行ったところFoxo６は培養骨格筋細胞を強く分化誘導することを見出した。ただし先行研究においてFoxo６は骨格筋細胞の分化を促進することが報告されており、ＲＮＡ干渉による分化誘導とは逆の挙動であることが示唆された。Foxo遺伝子群内でのオフターゲットの可能性は排除できないため複数のsiRNAを用いてFoxo６をノックダウンしたところ表現型の強弱は存在したがすべてのsiRNAにてFoxo6ノックダウンは骨格筋細胞の分化を誘導することが確認できた。