イメージング技術を用いた骨伸展時の骨細胞動態と骨リモデリング制御の解析

まず、伸展刺激装置における骨代謝細胞ネットワーク再現系の構築のために、ストレックス社のストレッチチャンバーに、全身の細胞が緑色蛍光タンパク質を発現するEGFPマウス頭頂骨より採取した骨芽細胞を播種し、培養した。細胞がコンフルエントになった日をDay0 とし、βGlycerophosphateおよびAscorbic acidを含む骨芽細胞分化培地での培養を開始した。約4週後に石灰化結節の形成を肉眼的に、および顕微鏡下で確認した。その後、マクロファージおよび破骨細胞が赤色蛍光タンパク質を発現するRANK-Cre xR26-tdTomatoマウス由来骨髄マクロファージを加え、活性型ビタミンD、プロスタグランジンE2を添加した培地にて共培養を開始した。以降、1週間ごとに同一部位をニコン2光子顕微鏡A1 MPで観察した。伸展の頻度や伸展率について検討した結果、1週間に1回、伸展率は週2.5%, 5.0%が、チャンパーの破綻を生じない条件であることを確認した。また、伸展以外の力学的負荷を加える方法として、遠心刺激を与える試みを行った。50万細胞/6 cm dish相当でEGFPマウス由来骨芽細胞を播種し、分化培養を4週間行った後にRANK-Cre xR26-tdTomatoマウス由来骨髄マクロファージとの共存培養を開始した。その後再びβGlycerophosphateおよびAscorbic acidを含む骨芽細胞分化培地に切り替え、遠心（1回30分，週3回　20 G, 200 G, 2000 G）を加えた。以降、1週間ごとに同一部位をニコン2光子顕微鏡A1 MPで観察した。

まず、伸展刺激装置における骨代謝細胞ネットワーク再現系の構築のために、ストレックス社のストレッチチャンバーに、全身の細胞が緑色蛍光タンパク質を発現するEGFPマウス頭頂骨より採取した骨芽細胞を播種し、培養した。細胞がコンフルエントになった日をDay0 とし、βGlycerophosphateおよびAscorbic acidを含む骨芽細胞分化培地での培養を開始した。約4週後に石灰化結節の形成を肉眼的に、および顕微鏡下で確認した。その後、マクロファージおよび破骨細胞が赤色蛍光タンパク質を発現するRANK-Cre xR26-tdTomatoマウス由来骨髄マクロファージを加え、活性型ビタミンD、プロスタグランジンE2を添加した培地にて共培養を開始した。以降、1週間ごとに同一部位をニコン2光子顕微鏡A1 MPで観察した。伸展の頻度や伸展率について検討した結果、1週間に1回、伸展率は週2.5%, 5.0%が、チャンパーの破綻を生じない条件であることを確認した。また、伸展以外の力学的負荷を加える方法として、遠心刺激を与える試みを行った。50万細胞/6 cm dish相当でEGFPマウス由来骨芽細胞を播種し、分化培養を4週間行った後にRANK-Cre xR26-tdTomatoマウス由来骨髄マクロファージとの共存培養を開始した。その後再びβGlycerophosphateおよびAscorbic acidを含む骨芽細胞分化培地に切り替え、遠心（1回30分，週3回　20 G, 200 G, 2000 G）を加えた。以降、1週間ごとに同一部位をニコン2光子顕微鏡A1 MPで観察した。