Development of super-resolution microscopy using unstained specimens and its application for tracking intracellular distribution of photosynthetic pigments

本研究では，線形，および非線形分光法を応用した新しい超解像度顕微鏡法を開発することにより，試料を染色することなく回折限界を超える空間分解能で顕微鏡画像の取得する方法を確立することを目指している．開発する手法の有効性を示すために，光合成色素の細胞内分布を従来の顕微鏡観察よりも高分解能で可視化を実現する．カロテノイドやクロロフィルといった光合成色素において，励起状態の細胞内分布をリアルタイムで決定することにより，光合成生物の細胞中で行われる光阻害からの防御機能の出現，およびその情報が伝達する様子を二次元マップとして提示することを最終目標としている．これまでの研究において，Stimulated emission depletion (STED) 法やGround state depletion (GSD) 法を用いた超解像度顕微鏡を構築し，顕微画像の取得にも成功している．本年度はこの装置を改造し，Fluorescence emission difference (FED) 法による超解像度画像の取得を目指した．励起光源には，これまで532nmのDPSSレーザーを用いてきたが，シアノバクテリアのフィコビリソームの直接励起が可能となるように435nmのDPSSも導入した．このレーザーのビーム形状は楕円形をしているが，FED法を適応するためにはビーム形状を円形にする必要がある．そのため，光学系の大幅な変更を行った．本年度の研究においては目標とする空間分解能に達することができなかったため，次年度も光学系の改良を継続する必要がある．また本年度は，スペクトル分解による空間分解能の向上を目指した研究も行った．シアノバクテリアの顕微蛍光画像をスペクトル分解することにより，フィコシアニン，アロフィコシアニン，フィコエリスリン，クロロフィルaの細胞内分布の可視化に成功した．

本研究では，線形，および非線形分光法を応用した新しい超解像度顕微鏡法を開発することにより，試料を染色することなく回折限界を超える空間分解能で顕微鏡画像の取得する方法を確立することを目指している．開発する手法の有効性を示すために，光合成色素の細胞内分布を従来の顕微鏡観察よりも高分解能で可視化を実現する．カロテノイドやクロロフィルといった光合成色素において，励起状態の細胞内分布をリアルタイムで決定することにより，光合成生物の細胞中で行われる光阻害からの防御機能の出現，およびその情報が伝達する様子を二次元マップとして提示することを最終目標としている．これまでの研究において，Stimulated emission depletion (STED) 法やGround state depletion (GSD) 法を用いた超解像度顕微鏡を構築し，顕微画像の取得にも成功している．本年度はこの装置を改造し，Fluorescence emission difference (FED) 法による超解像度画像の取得を目指した．励起光源には，これまで532nmのDPSSレーザーを用いてきたが，シアノバクテリアのフィコビリソームの直接励起が可能となるように435nmのDPSSも導入した．このレーザーのビーム形状は楕円形をしているが，FED法を適応するためにはビーム形状を円形にする必要がある．そのため，光学系の大幅な変更を行った．本年度の研究においては目標とする空間分解能に達することができなかったため，次年度も光学系の改良を継続する必要がある．また本年度は，スペクトル分解による空間分解能の向上を目指した研究も行った．シアノバクテリアの顕微蛍光画像をスペクトル分解することにより，フィコシアニン，アロフィコシアニン，フィコエリスリン，クロロフィルaの細胞内分布の可視化に成功した．