Functional analysis of clock gene orthologues in plant-associated bacteria in the phyllosphere and rhizosphere

叶际和根际植物相关细菌时钟基因直系同源物的功能分析

• 批准号: 22K05394
• 负责人: 井口 博之
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kyoto University of Advanced Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05394/
• 关键词: 概日時計; 植物共生細菌; 時計遺伝子; 環境応答

日周変動と関わりが深い植物環境に生息する細菌において、時計遺伝子（kai遺伝子）オルソログの機能解明を目指している。これまでに葉面細菌Methylobacterium extorquensが2コピー持つkaiCがストレス耐性を制御し、葉上の生育に寄与することを明らかにしてきた。本研究では、M. extorquensに加えて根粒菌M. nodulansを用い、多様な環境因子が存在する植物環境（葉上・根上）におけるkai遺伝子の機能解明、および制御遺伝子kaiRやkaiKを含めたkai制御系の制御機構の解明を目指す。それにより、植物上での生育に係る微生物機能や時計遺伝子の機能進化について理解を深化させる。今年度は以下の研究に取り組んだ。(1)kaiC遺伝子の葉上での発現レベル：　　in vitro実験ではM. extorquensのkaiCが青色光や熱に転写応答することが分かっているが、葉上でいつ機能しているか不明である。機能の指標を、kaiC遺伝子発現レベルとKaiCタンパクのリン酸化レベルと考えた。まずkaiCプロモーターにレポーター遺伝子を連結したレポーター系を導入した本菌をシロイヌナズナに接種し、一日（昼夜サイクル）の中での発現レベルを解析した。(2)kai遺伝子を介した制御機構：　　M. extorquensにおいて、KaiRのKaiCリン酸化への影響を調べるため、遺伝子破壊株についてPhos-tag SDS-PAGEを行った。またM. nodulansにおいてはkaiC破壊株とkaiK破壊株の構築を進めた。(3)kaiC遺伝子の時計機能：　　M. extorquensのkaiCが時計機能を有するのか調べるため、レポーター系を用いた経時モニタリングにより遺伝子発現レベルを測定し、遺伝子発現の概日リズムが生じる培養条件を探索した。

我们旨在阐明生活在与昼夜波动密切相关的植物环境中的细菌中时钟基因的功能。迄今为止，已经揭示了KAIC具有两个副本的叶细菌甲基杆菌的副本，可调节胁迫耐受性并有助于叶片生长。在这项研究中，除了脱胚菌外，我们还使用根瘤菌大麻菌，旨在阐明Kai基因在存在各种环境因素（叶子上和根部）的植物环境中的功能，并阐明包括调节性基因Kair Kair Kair和Kaik在内的KAI调节系统的调节机制。这将加深我们对与植物生长有关的微生物功能以及时钟基因的功能演变的理解。今年，我们从事以下研究：（1）叶子上KAIC基因的表达水平：在体外实验中，众所周知，M. Estorqorquens中的Kaic在转录上对蓝光和热量有反应，但何时在叶子上起作用时尚不清楚。功能指标被认为是KAIC基因表达水平和KAIC蛋白的磷酸化水平。首先，该细菌接种了拟南芥，该细菌具有与KAIC启动子相关的报告基因系统，并且在一天（昼夜周期）中分析了表达水平。 （2）通过KAI基因的调节机制：为了研究KAIR对质量大孢子的KAIC磷酸化的影响，对基因破坏菌株进行了PHOS-TAG SDS-PAGE。此外，M。Nodulans一直在努力建立Kaic和Kaik的破坏菌株。 （3）KAIC基因的时钟功能：为了研究M. Exporquens中的KAIC是否具有时钟功能，通过使用报告基因系统随着时间的流逝监测基因表达水平，并探索了导致基因表达昼夜节律的培养条件。

项目成果

植物共生細菌の時計遺伝子オルソログkaiCの制御・発現に関わる制御因子と環境因子

植物共生菌时钟基因直系同源物 kaiC 调控和表达的调控因子和环境因素

• 发表时间: 2023
• 作者: 日野 未来;深澤 茉愛;長安 伶奈;西山 辰也;富田 武郎;西山 真;上田 賢志;井口博之
• 通讯作者: 井口博之