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Elucidation of the reaction mechanism of a novel non-heme diiron enzyme, alpha-aminoisobutyrate hydroxylase, and its application

新型非血红素二铁酶α-氨基异丁酸羟化酶反应机制的阐明及其应用

基本信息

批准号：
22K05389
负责人：
日比慎
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Toyama Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

令和４年度は以下の研究項目を実施した。「A. 活性中心の解析」AibH1H2活性中心の分子構造を分析するために、立体構造解析を実施する。この解析のためには、高純度に精製されたAibH1H2タンパク質が必要であり、まずは組換え微生物の大量培養と各種クロマトグラフィーによるタンパク質精製を行った。得られたサンプルはSDS-PAGE上で高純度で精製できていることが確認され、以後の実験に使用するのに十分な品質であった。次いで立体構造を解析するためにクライオEM解析を行った。基質-酵素複合体の解析のために、AibH1H2と基質Aibの混合液を使用した。作成した酵素溶液は、KEKクライオ電顕施設で測定を行った。現在電顕データを解析中であり、構造情報が得られ次第、詳細な構造解析を実施する予定である。「B. タンパク質工学によるAibHYDの機能改変」AibH1H2変異体酵素を作成し、新しい産業用酸化触媒として利用できる酵素分子の開発を目指す。まずはAibHYD活性評価用菌株の最適な反応条件の検討を行った。具体的には、培養温度・誘導剤濃度と添加タイミング・基質濃度と添加タイミング・エネルギー分子の添加などの効果を検討し、最適な反応条件を決定した。次に既知のAibH1H2立体構造を使用したモデリング解析から想定される、基質結合部位を形成するアミノ酸残基を抽出し、変異導入のターゲットとした。変異体酵素を作製する方法として、幾つかの異なる部位特異的変異導入法を試したところ、最も効率よく変異を導入できる手法を決定することができた。また変異体酵素の解析に使用するAibのアナログ化合物に関して、まずは野生型酵素に対する反応性の評価を開始した。各種Aibアナログ化合物とその生成物をキラル分離分析できる分析系の検討も行っており、すでにLC-MS法を用いた分析法を確立している。

The following research projects were carried out in 2004:「A. Analysis of the active center "Molecular structure analysis of the active center of AibH1H2, stereo structure analysis and implementation. The analysis and purification of this kind of microorganism are necessary. High purity on SDS-PAGE, high quality for subsequent use The analysis of three-dimensional structure is carried out by EM analysis. Analysis of matrix-enzyme complexes using mixtures of AibH1H2 and matrix Aib Make enzyme solution, KEK, and conduct measurement. Now the structure information is obtained in the order of analysis, and the detailed structure analysis is performed in the predetermined order.「B. AIBHYD Function Modification in Quality Engineering: Preparation of AIBH1H2 Heteroenzymes, Development of Novel Industrial Acidification Catalysts The optimum reaction conditions for the evaluation of AibHYD activity were investigated. The specific conditions, culture temperature, induction agent concentration, additive concentration, substrate concentration, additive concentration, additive effect, and optimal reaction conditions are determined. The second known Aib H1H2 stereostructure is used for analysis, determination, formation of matrix binding sites, extraction of acid residues, and introduction of heterostructures. The method of enzyme control and the method of site-specific enzyme introduction are tested, and the method of enzyme introduction is determined The analysis of alloenzymes begins with the evaluation of the activity of Aib and its related compounds and wild type enzymes. The analytical system for the separation and analysis of various Aib compounds and their products was established by LC-MS.