Modification and high expression of microbial enzyme genes aimed at the production of branced cycloisomaltooligosaccharides

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Leuconostoc citreum S-32株は環状イソマルトオリゴ糖（CI）に分岐鎖を導入する酵素を生産する有用な乳酸菌であるが、3種類のグルカンスクラーゼ遺伝子を持ち、うち1種類はCIへの分岐鎖を導入しないグルカンスクラーゼをコードすることが明らかになった。この遺伝子を相同組み換えによって遺伝子破壊することを目的として、遺伝子破壊用の変異プラスミドの構築を試みた。本遺伝子の一部を1塩基を欠損させる遺伝子断片を構築し、これと相同組み換えが起こることにより、活性のある酵素が生産できなくなるようにデザインした。当初pNZ7021を用いたが組換え体が得られなかったので、方針を変更してpUC19に導入した。他のデキストラン生産性の乳酸菌であるLeuconostoc mesenteroides NRRL B-512F株が保有する不活性なグルカンスクラーゼ遺伝子dsrTに5塩基補完したdsrT5遺伝子がコードするDSRT5タンパクに、CI-7（グルコース7分子から成るCI）にグルコース分岐を転移する活性が見られた。本菌株のゲノムDNAに直接5塩基補完することによってdsrTの欠損を修復し、CI-7に分岐鎖導入を行う酵素(DSRT5)を生産する乳酸菌の開発を試みた。pNZ7021に変異遺伝子断片の導入を試みたが、変異プラスミドは構築できなかった。Paenibacillus sp. 598K 株は澱粉からCIおよびサイクロデキストリン（CD）の生産能を持つ菌株である。本菌株は澱粉で培養すると優先的にCDを生産し、CIは少量しか生産しない性質があるため、CD生産酵素であるCGTase遺伝子を破壊することにより、澱粉からCIのみを生産する菌株に改変することを目指す。CGTase 遺伝子破壊用のベクターとして、pHSG398 ベクターを使用し、ベクターの線状化を完了したところである。