Isolation of high D-amino acid-producing bacteria by an enzymatic screening method and analysis of the high production mechanism

酶法筛选高产D-氨基酸菌及其高产机理分析

• 批准号: 22K05402
• 负责人: 高橋 祥司
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Nagaoka University of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05402/
• 关键词: D-アミノ酸; バクテリア; 乳酸菌; 高分泌生産; 酵素スクリーニング法; D-アミノ酸オキシダーゼ; 酵素スクリーニング; 微生物; 発酵生産

近年、医薬品原料として有用なD-アミノ酸の多様な生理効果が報告され、D-アミノ酸の広範な応用的利用が期待されている。また、細菌が多様なD-アミノ酸を細胞外に生産していることが明らかになってきた。申請者らは、高い安定性と活性を有し、かつ多様なD-アミノ酸に作用する酵素D-アミノ酸オキシダーゼ（DAO）を見いだした。そこで本研究では、申請者が見出した高活性・高安定性・広基質特異性DAOを用いたハイスループットな細胞外D-アミノ酸生産細菌のスクリーニング法を開発し、高いD-アミノ酸細胞外生産能を有する細菌株を単離・同定し、その生産機構を明らかにし、多様なD-アミノ酸の発酵生産法の開発や広範な応用的利用の基盤を築くことを目的とした。本年度は、環境試料から多数の細菌株を単離し、これら単離菌株のD-アミノ酸分泌生産に関して以下の成果を得た。環境試料から、3種類の培地を用いて、計357株の細菌株を単離した。また、培養液上清のDAOを用いた酵素法による定量法を開発した。開発したD-アミノ酸の酵素定量法を用いて、全単離菌株の培養液上清のD-アミノ酸を測定したところ、高いD-アミノ酸分泌生産能を示す細菌株を6株得た。今後、D-アミノ酸高分泌生産株が生産するD-アミノ酸の種類と量を明らかにするとともに、培養条件がそのD-アミノ酸分泌生産能に及ぼす影響を明らかにする予定である。また、D-アミノ酸高分泌生産株のゲノム配列を明らかにし、D-アミノ酸生合成酵素を同定し、その酵素学的緒特性を明らかにする予定である。

In recent years, various physiological effects of D-amino acids have been reported, and the utilization of D-amino acids for various purposes has been expected. In addition, bacteria produce many kinds of acids in vitro. The applicant has high stability and activity, and the enzyme D-A-N-A-N-A In this study, the applicants have found that high activity, high stability, and substrate specificity of DAO can be used to develop a method for the isolation, identification, and identification of bacterial strains capable of producing extracellular D-acid. The development of a multi-dimensional acid evolution production process and the construction of a substrate for its application This year, most of the bacterial strains were isolated from environmental samples, and the following results were obtained from isolated strains for D-acid secretion production. The environmental samples were collected from three different cultures, and 357 bacterial strains were isolated. The enzyme method and quantitative method were used to develop DAO in culture supernatant. An enzyme quantitative method for D-aminophenol was developed, and D-aminophenol in culture supernatant of completely isolated strains was measured. Six bacterial strains were obtained to demonstrate high D-aminophenol secretion and production. In the future, the production of D-2-acid by high D-2-acid secreting strains will be determined in terms of the type, quantity and culture conditions of D-2-acid secreting production. In addition, the necessary gene configuration of the D-amino acid-secreting production strain will be clarified, the D-amino acid-producing synthase will be determined, and the enzymatic characteristics of the strain will be determined.

项目成果

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細菌 Arthrobacter protophormiae 由来 D-アミノ酸オキ シダーゼの塩基性 D-アミノ酸酸化活性に寄与する構造 因子

有助于源自原节杆菌细菌的 D-氨基酸氧化酶的基本 D-氨基酸氧化活性的结构因素

• 发表时间: 2022
• 作者: 松永陽平;高橋祥司
• 通讯作者: 高橋祥司

D,L-アスパラギン酸培養時の酵母Cryptococcus humicolaにおける発現変動遺伝子

D,L-天冬氨酸培养过程中酵母菌腐殖质隐球菌中表达变化的基因

• 发表时间: 2022
• 作者: 今西大生;高橋祥司
• 通讯作者: 高橋祥司

Arthrobacter protophormiae D-アミノ酸オキシダーゼの 塩基性D-アミノ酸酸化活性に寄与する構造的要因の解明

阐明原节杆菌 D-氨基酸氧化酶的碱性 D-氨基酸氧化活性的结构因素

• 发表时间: 2022
• 作者: 松永陽平;高橋祥司
• 通讯作者: 高橋祥司

Mechanism of high d-aspartate production in the lactic acid bacterium Latilactobacillus sp. strain WDN19

• DOI: 10.1007/s00253-022-11870-w
• 发表时间: 2022-03
• 期刊: Applied Microbiology and Biotechnology
• 影响因子: 5
• 作者: Kengo Kajitani;T. Ishikawa;Tomohiro Kobayashi;Miharu Asato;K. Shibata;Tomoaki Kouya;Shouji Takahashi-Shouji-T