Elucidation of the sugar carrier lipid supply pathway to the bacterial cell wall synthesis system and its regulation

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本研究の目的は黄色ブドウ球菌において細胞壁合成の糖キャリアであるウンデカプレニルリン酸（UP）の細胞膜内側への供給に関わる遺伝子を同定し、その発現調節を解明することである。初年度、黄色ブドウ球菌リピドホスファターゼ遺伝子産物の酵素活性の確認、UPおよびその直近の前駆体であるウンデカプレニル二リン酸（UPP）の細胞内含量の測定法の検討、および、黄色ブドウ球菌における遺伝子発現測定の予備実験を行った。黄色ブドウ球菌のpptB遺伝子を大腸菌で発現して得たタンパク質が、プレニル二リン酸を順時加水分解してプレニルリン酸、プレノールを生成する活性を有することを確認した。市販品のソラネソールをリン酸化して調製したソラネシルリン酸およびソラネシル二リン酸を標準物質として、これらの物質の溶媒抽出、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）における挙動を確認した。その結果、菌体からプレニルリン酸、プレニル二リン酸を抽出し、イオン交換カートリッジにより分別したのち、イオンペア試薬を含む溶媒を用いるHPLC分析により炭素数35から60のプレニルリン酸、プレニル二リン酸を定量する方法を確立した。従来は菌をアルカリ処理し加水分解により生じたプレニルリン酸をHPLCで分析していたので、リン酸エステル誘導体総量の測定であったが、本研究成果によりUPとUPPを別々に定量して細胞内におけるUPPの脱リン酸化の程度を知ることが可能となった。黄色ブドウ球菌においてUPの合成に関わると予想される7個の遺伝子の蛍光プローブを作成した。黄色ブドウ球菌の対数増殖期および定常期まで培養した菌体からRNAを調製してリアルタイムPCRによりこれらの遺伝子由来のRNAを測定した。ゲノムDNAを除去する条件等を検討し、関連遺伝子の欠損および培養条件による遺伝子発現の変化の検出が可能になった。