Elucidation of the sugar carrier lipid supply pathway to the bacterial cell wall synthesis system and its regulation

阐明细菌细胞壁合成系统的糖载体脂质供应途径及其调控

• 批准号: 22K05391
• 负责人: 藤崎 真吾
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Toho University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05391/
• 关键词: ウンデカプレニルリン酸; ウンデカプレニル二リン酸; 高速液体クロマトグラフィー; イオンペア試薬; リアルタイムPCR; 糖キャリアリピド; リピドホスファターゼ; リピドキナーゼ; 細胞壁合成

本研究の目的は黄色ブドウ球菌において細胞壁合成の糖キャリアであるウンデカプレニルリン酸（UP）の細胞膜内側への供給に関わる遺伝子を同定し、その発現調節を解明することである。初年度、黄色ブドウ球菌リピドホスファターゼ遺伝子産物の酵素活性の確認、UPおよびその直近の前駆体であるウンデカプレニル二リン酸（UPP）の細胞内含量の測定法の検討、および、黄色ブドウ球菌における遺伝子発現測定の予備実験を行った。黄色ブドウ球菌のpptB遺伝子を大腸菌で発現して得たタンパク質が、プレニル二リン酸を順時加水分解してプレニルリン酸、プレノールを生成する活性を有することを確認した。市販品のソラネソールをリン酸化して調製したソラネシルリン酸およびソラネシル二リン酸を標準物質として、これらの物質の溶媒抽出、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）における挙動を確認した。その結果、菌体からプレニルリン酸、プレニル二リン酸を抽出し、イオン交換カートリッジにより分別したのち、イオンペア試薬を含む溶媒を用いるHPLC分析により炭素数35から60のプレニルリン酸、プレニル二リン酸を定量する方法を確立した。従来は菌をアルカリ処理し加水分解により生じたプレニルリン酸をHPLCで分析していたので、リン酸エステル誘導体総量の測定であったが、本研究成果によりUPとUPPを別々に定量して細胞内におけるUPPの脱リン酸化の程度を知ることが可能となった。黄色ブドウ球菌においてUPの合成に関わると予想される7個の遺伝子の蛍光プローブを作成した。黄色ブドウ球菌の対数増殖期および定常期まで培養した菌体からRNAを調製してリアルタイムPCRによりこれらの遺伝子由来のRNAを測定した。ゲノムDNAを除去する条件等を検討し、関連遺伝子の欠損および培養条件による遺伝子発現の変化の検出が可能になった。

The aim of this study was to clarify the regulation of glucose metabolism in cell wall synthesis of Pseudomonas flava by regulating the metabolism of glucose and glucose (UP) in cell membrane. In the early years, confirmation of enzyme activity of the protein product of yellow beetles, investigation of the cell content assay of UPP, preparation of the protein production assay of yellow beetles, and preparation of the assay of UPP. The pptB gene of yellow bacteria was found in Escherichia coli, and the activity of hydrolysis and production of hydrochloric acid was confirmed. The solvent extraction of commercial products, such as standard substances, solvent exchange, high speed liquid chromatography (HPLC), and high speed liquid chromatography (HPLC) are confirmed. The results showed that the method for quantitative analysis of protonic acid and protonic acid with carbon number from 35 to 60 was established by HPLC. The results of this study indicate that UPP can be quantified by HPLC analysis. The synthesis of yellow pigment and yellow pigment is related to the synthesis of seven kinds of pigment. The growth period and the steady state period of the yellow bacteria were measured by PCR and RNA modulation. The conditions for DNA removal, the defects of related genes, and the conditions for culture are discussed.

项目成果

Liquid chromatography-mass spectrometry analyses of polyprenyl phosphates in Escherichia coli cells in which genes for isoprenoid synthesis are amplified.

对大肠杆菌细胞中的聚异戊二烯磷酸酯进行液相色谱-质谱分析，其中类异戊二烯合成基因被扩增。

• 发表时间: 2023
• 期刊: Journal of Bioscience and Bioengineering
• 影响因子: 2.8
• 作者: Yoshimitsu Murata;Tomotaka Jitsukawa;M. Iida;T. Furuta;Yoshikazu Haramoto;Y. Shigeri;S. Fujisaki
• 通讯作者: S. Fujisaki

黄色ブドウ球菌由来リピドホスファターゼ遺伝子の発現による大腸菌の脂質代謝の改変

通过金黄色葡萄球菌衍生的脂质磷酸酶基因的表达改变大肠杆菌中的脂质代谢

• 发表时间: 2022
• 作者: 宮奈々恵;大村梨沙子;小倉智康;末永修一;實川智貴;藤崎真吾
• 通讯作者: 藤崎真吾