Elucidation of the biogenesis mechanism of amine dehydrogenase by development of a low-cytotoxicity genome editing technique for bacteria

通过开发细菌低细胞毒性基因组编辑技术阐明胺脱氢酶的生物发生机制

• 批准号: 22K05419
• 负责人: 中井 忠志
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Hiroshima Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05419/
• 关键词: ゲノム編集; 補酵素の生合成; タンパク質工学; 酵素触媒機構; Paracoccus denitrificans; 広宿主域ベクター; 発現制御機構; 翻訳後修飾

本研究では、タンパク質の翻訳後修飾反応により形成されるビルトイン型キノン補酵素、システイントリプトフィルキノン（CTQ）を有するキノヘムプロテイン・アミン脱水素酵素（QHNDH）を対象とした。特に、最後まで未解明のままになっているCTQの生成機構を明らかにすることで、多段階の翻訳後修飾反応によるQHNDHの生合成プロセスを統合的に解明することと、QHNDH生産菌であるParacoccus denitrificansに適用可能な細菌の低細胞毒性ゲノム編集技術を確立することも目的とした。2022年度は、広宿主域ゲノム編集用プラスミドの構築を中心に研究を実施した。プラスミドベクターとして広宿主域のpBBR122およびpRK415を用いた。Cas9遺伝子は約5000 bpと大きいが、5分割した各断片をpUC19にクローニングした後、Golden Gate Assembly法により再結合すると同時にベクターに挿入した。各断片をクローンごとに改変してから再結合が可能で、複数遺伝子の融合が必要なプラスミドでも無理なく構築できることを確認した。次に、IPTGまたは無水テトラサイクリンの培地への添加により広宿主で発現誘導可能なゲノム編集用プラスミドを構築した。まずは大腸菌に導入し、塩基編集法およびプライム編集法によるlacZ遺伝子の編集を試みたところ、ゲノムに意図する変異を導入できることを確認した。一方、P. denitrificansでの誘導時には、これらプロモーター活性が低いことが判明したため、プロモーターおよびオペレータ配列の最適化を現在進めている。今後は、決定した最適配列に置き換えたプラスミドをP. denitrificansに導入し、qhp遺伝子に変異を導入しQHNDHの翻訳後修飾機構の解析に用いる予定である。

In this study, we investigated the formation of a new type of enzyme, a new type of enzyme (CTQ), and a new type of enzyme (QHNDH). In particular, in the final analysis, the mechanism for the production of CTQ is to be clarified, and the multi-stage post-inversion modified reaction is to be used to integrate the production of QHNDH, and the production of QHNDH by Paracoccus dendrificans is to be established as a low cytotoxicity compilation technology for bacteria. In 2022, the research on the construction of the center for the compilation and application of the host domain was carried out. The pBBR122 and pRK415 of the host domain are used in the search engine. Cas9 gene is about 5000 bp long, 5-segment, and each fragment is pUC19. The gene is divided into two parts: the first part and the second part. The fusion of multiple fragments is necessary for rational construction. In addition, IPTG can also be added to the media to induce the development of a host system. The introduction of E. coli into the genome and the compilation of E. coli into the genome were confirmed. In the case of P. denitrificans, the induction time is low, and the activity is low. The optimization of the arrangement is now advanced. In the future, we will decide the most suitable column for you. Denitrificans are introduced into QHNDH, QHP is introduced into QHNDH, QHNDH is introduced into QHNHNHN