活性酸素種を量産する細胞質フラビン酵素が酸素に応答する現象・機構の解明

本研究では、ニンニクのクラスB型フラビン含有酸素添加酵素（BFMO）であるAsFMO1について生化学・生物生産・構造解析の諸実験を行ってBFMO活性を調節する因子を探し出すこと、触媒サイクルにおける複雑な中間状態を調査することを課題としている。本年度は酵素主反応であるアリイン生成活性、ならびにAsFMO1の活性発揮機序の探索を目的とする以下の実験を行った。１.アリイン合成を変動させる手段の探索に対しては、基質S-アリルシステインを添加してAsFMO1発現大腸菌を培養した細胞抽出液におけるアリインを調査した。酵素アリイナーゼ添加に応じたアリイン代謝物の検出は極微量であり、細胞内因子によるアリイン生成増強は観測されなかった。加えて、AsFMO1やAsFMO1とヒト肝臓ミクロソームで機能する哺乳類祖先型フラビンモノオキシゲナーゼAncFMO2を精製し、精製酵素に対して反応溶液中の溶存酸素濃度変化を電気化学測定により追跡した。その結果、NADPH添加に応じた酸素消費速度の増減は認められなかった。また、同一条件下でのNADPH消費活性と過酸化水素生成を呈色反応で計測したところ、AncFMO2のNADPH酸化能力はAsFMO1の約半分であり、AsFMO1, AncFMO2がNADPHの還元力を過酸化水素生成に転換する効率は20-25%程度であること、AncFMO2の活性酸素の生成能力はAsFMO1に対して40%程度であることがわかった。２.AsFMO1の活性発揮機序の探索に対しては、過酸化水素を含有させた反応液のAsFMO1反応時の過酸化水素濃度変化を計測した。生成／消費速度に変化はみられなかったことからAsFMO1はペルオキシダーゼ活性をもたず、過酸化水素を酸素から生成する方向にのみ触媒することが示された。

本研究では、ニンニクのクラスB型フラビン含有酸素添加酵素（BFMO）であるAsFMO1について生化学・生物生産・構造解析の諸実験を行ってBFMO活性を調節する因子を探し出すこと、触媒サイクルにおける複雑な中間状態を調査することを課題としている。本年度は酵素主反応であるアリイン生成活性、ならびにAsFMO1の活性発揮機序の探索を目的とする以下の実験を行った。１.アリイン合成を変動させる手段の探索に対しては、基質S-アリルシステインを添加してAsFMO1発現大腸菌を培養した細胞抽出液におけるアリインを調査した。酵素アリイナーゼ添加に応じたアリイン代謝物の検出は極微量であり、細胞内因子によるアリイン生成増強は観測されなかった。加えて、AsFMO1やAsFMO1とヒト肝臓ミクロソームで機能する哺乳類祖先型フラビンモノオキシゲナーゼAncFMO2を精製し、精製酵素に対して反応溶液中の溶存酸素濃度変化を電気化学測定により追跡した。その結果、NADPH添加に応じた酸素消費速度の増減は認められなかった。また、同一条件下でのNADPH消費活性と過酸化水素生成を呈色反応で計測したところ、AncFMO2のNADPH酸化能力はAsFMO1の約半分であり、AsFMO1, AncFMO2がNADPHの還元力を過酸化水素生成に転換する効率は20-25%程度であること、AncFMO2の活性酸素の生成能力はAsFMO1に対して40%程度であることがわかった。２.AsFMO1の活性発揮機序の探索に対しては、過酸化水素を含有させた反応液のAsFMO1反応時の過酸化水素濃度変化を計測した。生成／消費速度に変化はみられなかったことからAsFMO1はペルオキシダーゼ活性をもたず、過酸化水素を酸素から生成する方向にのみ触媒することが示された。