Elucidation of enzyme function by X-ray crystal structure at room temperature.

酵素の多才な機能は酵素タンパク質の構造変化によって発揮される。タンパク質の構造変化を研究する手段としてはX線結晶構造解析が最も有効であるが、結晶中のタンパク質は結晶中で対称分子と相互作用しているために、構造変化を捉えるには対象部位の構造変化が結晶中で観察できる結晶を調製する必要がある。一般に行われている回折データの測定では分解能を向上させるため凍結結晶を用いるため、凍結による結晶格子の縮小とpHの変化の影響が大きく、真の構造変化を捉えるのが困難である。さらに、凍結保護剤の影響も無視できない。本研究では簡便なキャピラリー測定法を開発し、非凍結法を駆使した酵素と基質の複合体構造のpH変化を正確に捉えることで酵素機能の解明を行う。対象の酵素としては申請者が研究しているβ-アミラーゼの他、ソーマチン、CYP105A1、プロテイングルタミナーゼ、トランスグルタミナーゼ、コラーゲナーゼ、MHCクラスI分子等について、基質およびリガンドとの複合体のｐHの変化による構造変化を明らかにすることを試みている。令和4年度は簡便なキャピラリー測定法の開発とキャピラリーを用いたβ-アミラーゼの基質複合体の非凍結測定を用いた活性部位構造のpH変化およびCYP105Aと非ステロイド系消炎剤との複合体の凍結結晶とキャピラリーを用いた非凍結結晶の構造比較を行った。さらに、ソーマチンのpHによる構造変化を明らかにするために、キャピラリーを用いた測定をpHを3.5～11まで変化させて行った。これらの構造解析の計算の効率化を図るためにファイルサーバーを導入した。

酵素の多才な機能は酵素タンパク質の構造変化によって発揮される。タンパク質の構造変化を研究する手段としてはX線結晶構造解析が最も有効であるが、結晶中のタンパク質は結晶中で対称分子と相互作用しているために、構造変化を捉えるには対象部位の構造変化が結晶中で観察できる結晶を調製する必要がある。一般に行われている回折データの測定では分解能を向上させるため凍結結晶を用いるため、凍結による結晶格子の縮小とpHの変化の影響が大きく、真の構造変化を捉えるのが困難である。さらに、凍結保護剤の影響も無視できない。本研究では簡便なキャピラリー測定法を開発し、非凍結法を駆使した酵素と基質の複合体構造のpH変化を正確に捉えることで酵素機能の解明を行う。対象の酵素としては申請者が研究しているβ-アミラーゼの他、ソーマチン、CYP105A1、プロテイングルタミナーゼ、トランスグルタミナーゼ、コラーゲナーゼ、MHCクラスI分子等について、基質およびリガンドとの複合体のｐHの変化による構造変化を明らかにすることを試みている。令和4年度は簡便なキャピラリー測定法の開発とキャピラリーを用いたβ-アミラーゼの基質複合体の非凍結測定を用いた活性部位構造のpH変化およびCYP105Aと非ステロイド系消炎剤との複合体の凍結結晶とキャピラリーを用いた非凍結結晶の構造比較を行った。さらに、ソーマチンのpHによる構造変化を明らかにするために、キャピラリーを用いた測定をpHを3.5～11まで変化させて行った。これらの構造解析の計算の効率化を図るためにファイルサーバーを導入した。