グラミン生合成の鍵となる新規転位反応とcyt. P450の解析

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オオムギは、グラミンをトリプトファン(Trp)から生合成する。その生合成過程で、Trp側鎖の炭素原子が2個分減少してアミノメチルインドール(AMI)が生成するが、その経路の詳細はこれまで明らかになっていない。最近の我々の研究で、この反応には炭素-窒素 (C-N) 間の新規転位反応を行う新規cyt. P450 (CYP)の関与が示唆されたことから、本課題では、グラミン生合成経路の解明とオオムギ由来新規CYPの反応機構解析を目指した。本年度はまず、イネにCYPとNMT (AMIからグラミンを合成する酵素)を導入し、代謝産物を解析した結果、形質転換体においてAMIとグラミンの生産がLC-MS上で確認でき、このCYPがグラミン生合成に関わっていることが強く示された。CYPの機能をより直接的に評価するため、CYP遺伝子を酵母Pichia pastorisに導入し、ミクロソーム画分を調製することでその活性をin vitroで検出することを試みた。その際には、CYPに電子を供給するために、シロイヌナズナ由来CYP還元酵素であるATR1を同時に発現させた。ミクロソーム画分をTrpに対して反応させたところ、AMIの生成が確認できたことから、この新規CYPはTrpを直接AMIに変換する活性を持つことが示された。Trp側鎖の炭素2個を1段階で除去する酵素はこれまで知られておらず、このCYPが新規の反応を触媒していることが示唆された。また、オオムギ新規CYPの反応を詳細に解析するため、主にTrpの構造類縁体を用いて、それらに対する反応性や、Trp-AMI変換活性に対する影響をミクロソーム画分を用いて検討した。結果として、Trpのメチルエステル体などが阻害剤となる可能性が示され、今後、阻害様式の精査や構造展開を行うことで反応機構解析に供試しうる阻害剤の開発につながる可能性がある。