マメ科の共通物質coumestrolの生合成と生態機能の解析

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Coumestrolは多くのマメ科植物が蓄積する「共通物質」であり，イソフラボノイドの一種である.この化合物は細胞内では核に存在し，しかもエストロゲンと構造が類似している．このためcoumestrolは，マメ科植物内でシグナル伝達など重要な役割を果たしている可能性が示唆された. しかしこれまでのところ，生態生理における役割は明らかではない.本研究ではcoumestrolの生合成機構と関与する酵素遺伝子を明らかにし，遺伝子からのアプローチによりマメ科植物におけるcoumestrolの役割を明らかにする．これまでの研究で，isoflav-3-eneからcoumestrolがつくられることをダイズの粗酵素液を用いた酵素アッセイで明らかにしている．しかしisoflav-3-eneは市販されておらず，また不安定な化合物である．このため植物の遺伝子を組み込んだ組換え大腸菌を用いて簡便で効率的な調製法を確立した．各種阻害剤を用いた植物の粗酵素液と基質を用いた酵素アッセイにより，coumestrol生合成の最後のステップには酸化酵素が関与していることが明らかになった．ダイズ，カンゾウ，ミヤコグサなどのRNA-シーケンス解析を行い，酸化酵素の候補遺伝子を数種選抜した．植物から候補cDNAのクローニングを行った．大腸菌・酵母などで発現させ，組換え酵素タンパク質を用いて機能解析を行うために発現ベクターを作成した．cDNAクロ-ニングができなったものは，人工合成遺伝子を用いて発現ベクターの作成を行った．