トマトのゲノム編集によるノックイン技術の確立及び発現調節法の開発

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本課題では、近年目覚ましく進歩するゲノム編集技術をさらに高度化することを目的として、現状のゲノム編集技術として多用される狙った位置への突然変異誘発ではなく、ゲノム上の狙った位置に任意のDNA配列を相同組換えにより挿入する技術、いわゆるノックイン技術をトマトにおいて確立すること、さらにその応用例として、①タンパク質の発現を増強する翻訳エンハンサー配列をトマトから見出し、その配列をノックインすることで目的のタンパク質を発現する位置、場所を変更せずに高発現化させる技術、加えて、②転写因子の機能変更、例えば転写活性化因子を抑制因子に変更することによる生物特性の改変技術の開発を目的に、転写活性に関わるドメイン配列をコードするDNA断片のノックインを行う。本年度は①に関しては既存のウイルス由来の翻訳エンハンサー配列をカロテノイド合成系の遺伝子、あるいは離層形性制御に関わる転写因子遺伝子にノックインを試みた。いずれもトマトゲノムの標的位置にドナーとなるDNA断片が挿入された植物体を得たものの、詳細に解析すると、ドナー配列だけでなく、ドナー配列を植物細胞へ導入するためのベクター配列も付随して挿入されており、不完全に相同組換えした植物体しか得られなかった。また、②に関しても果実成熟促進に関わる転写因子に2種の転写抑制ドメインの挿入を試みたが、いずれも同様にやはり不完全なノックインを生じた植物しか得られなかった。不完全に入ったものの、目的のタンパク質配列をコードする遺伝子に変更できた可能性があったため植物体を育成してみたが、mRNAの配列を確認すると異常なスプライシングが発生していることが判明したため、ドナー配列の見直しが必要であることが判明した。