植物種間で異なる恒常的防衛・誘導的防衛メカニズムの分子進化

食害誘導性化合物の精製のためジャスモン酸処理をしたトマト葉を500g収穫し、メタノール抽出物を得た。本抽出物を液液分画により脂溶性夾雑物を除去したのち、ODSカラムによる分画によって粗精製物を得た。粗生成物のLC-MS/MS解析から、候補化合物がジヒドロカフェー酸様構造を持つことが明らかになった。この結果から精密質量から計算した組成式よりもより確からしい構造を推定することができたが、NMRによる構造解析を行うには至らなかったため引き続き原料量を増やして精製を行う必要がある。LC-MS/MSによる部分構造の解析から本化合物をより精度よく推定することができたため、その生合成に関わる遺伝子の探索を行った。2022年12月に類似化合物の生合成酵素遺伝子配列がトマトから単離され、その機能を生化学的に解析したプレプリント論文が一足先に発表されてしまった。当該論文では組換え酵素を用いた生化学的なin vitro解析のみを行っていたため、in vivoでどのような化合物を生合成するのかは明らかになっていない。特に本研究で目的とする推定化合物の材料は酵素反応に使われていなかったため、分からない。そこで当該論文で行われておらず、かつ本研究の目的化合物生合成酵素を明らかにする方法として、ゲノム編集トマトの作出によるin plantaでの遺伝子機能解明を行うこととする。プレプリントで発表された4遺伝子に加え、当該化合物から推測される生合成遺伝子1つを発見し、合計5遺伝子を候補遺伝子とした。各遺伝子のエクソン領域を認識し、かつ他の遺伝子とはお互いに認識しないgDNAを設計し、DNA合成の後にゲノム編集プラスミドにクローニングした。

食害誘導性化合物の精製のためジャスモン酸処理をしたトマト葉を500g収穫し、メタノール抽出物を得た。本抽出物を液液分画により脂溶性夾雑物を除去したのち、ODSカラムによる分画によって粗精製物を得た。粗生成物のLC-MS/MS解析から、候補化合物がジヒドロカフェー酸様構造を持つことが明らかになった。この結果から精密質量から計算した組成式よりもより確からしい構造を推定することができたが、NMRによる構造解析を行うには至らなかったため引き続き原料量を増やして精製を行う必要がある。LC-MS/MSによる部分構造の解析から本化合物をより精度よく推定することができたため、その生合成に関わる遺伝子の探索を行った。2022年12月に類似化合物の生合成酵素遺伝子配列がトマトから単離され、その機能を生化学的に解析したプレプリント論文が一足先に発表されてしまった。当該論文では組換え酵素を用いた生化学的なin vitro解析のみを行っていたため、in vivoでどのような化合物を生合成するのかは明らかになっていない。特に本研究で目的とする推定化合物の材料は酵素反応に使われていなかったため、分からない。そこで当該論文で行われておらず、かつ本研究の目的化合物生合成酵素を明らかにする方法として、ゲノム編集トマトの作出によるin plantaでの遺伝子機能解明を行うこととする。プレプリントで発表された4遺伝子に加え、当該化合物から推測される生合成遺伝子1つを発見し、合計5遺伝子を候補遺伝子とした。各遺伝子のエクソン領域を認識し、かつ他の遺伝子とはお互いに認識しないgDNAを設計し、DNA合成の後にゲノム編集プラスミドにクローニングした。