タバココナジラミ菌細胞を用いた新たな共生機能解析技術の開発

利用烟草粉虱细胞开发新型共生功能分析技术

• 批准号: 22K05672
• 负责人: 藤原 亜希子
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05672/
• 关键词: タバココナジラミ; 共生細菌; 菌細胞; 細胞培養; 初代培養; 吸汁性農業害虫; 機能解析手法; 培養細胞

吸汁性農業害虫の中には、共生細菌を収納するための“菌細胞”という特殊な共生器官を体内に持つものが多く存在する。この菌細胞共生系は、宿主昆虫と共生細菌が互いに不足する栄養素を補い合う生存・繁殖に必須のシステムであることから、生物学のみならず農学分野からも注目されている。しかし、その特異性ゆえに菌細胞共生系で使用できる簡便かつ効果的な遺伝子操作技術が不足しており、分子機構の多くは未解明である。そこで本課題では、「(I)タバココナジラミ菌細胞の長期安定維持手法の確立」、「(II)タバココナジラミ体細胞由来培養細胞株の樹立」、「(III)タバココナジラミ菌細胞由来培養細胞株の樹立」、「(IV)ハイコンテント解析使用条件の最適化」の４つの段階的な研究課題を設定して、タバココナジラミ菌細胞を用いた共生関連遺伝子の機能解析手法の開発を目指す。初年度、課題(I)ではまず、入手しやすい市販培養液のGrace’s insect medium、IPL-41を候補としベース培養液の検討を行った。その結果、IPL-41では培養後の時間経過に伴って細胞膜が維持されなくなり、細胞の形が崩れることが判明したため、Graceを選定した。続いて、FBS濃度の検討を行った結果、濃度を２０％に増やすことで、細胞膜が良好に維持され、菌細胞の色が濃い (共生細菌が生存している) 状態で長期維持でき、培養後の生存率向上に成功した。さらに、グルタミンとPVP（Polyvinylpyrrolidone K90) の添加についても検討を行った結果、Grace 20F + PVP 1mg/ml + glutamine 20mM条件において、培養７日後の菌細胞生存率約8割 (78.54 ± 2.129 %) が達成された。さらに、課題(II)では、タバココナジラミ卵を大量に回収しホモジナイズした状態から初代培養を開始した条件において、9ヶ月以上培養液中にて生存している状態 (位相差顕微鏡で細胞外観等の様子から確認)を維持しているサンプルが存在することを確認した。

The existence of symbiotic bacteria in succulent agricultural pests and in special symbiotic organs The symbiotic system of bacteria, host insects and symbiotic bacteria are deficient in each other, and nutrients are required for survival and reproduction. The use of specific bacterial cell symbiosis systems is not easy, and the molecular mechanisms are not yet understood. This project includes four research projects: (I) Establishment of long-term stability maintenance method for bacterial cells;(II) Establishment of somatic cell-derived culture cell line;(III) Establishment of bacterial cell-derived culture cell line;(IV) Optimization of analytical conditions for bacterial cells; The development of functional analysis methods for symbiotic related genes in the use of bacterial cells is described. In the first year, subject (I), Grace's insect medium, IPL-41, candidate and culture medium were discussed. The results of IPL-41 are as follows: The cell membrane is maintained after culture, and the cell shape is determined. The concentration of FBS was increased by 20%, the cell membrane was well maintained, the color of bacterial cells was concentrated (symbiotic bacteria survived), and the survival rate after culture was improved. In addition, the results of the study on the addition of PVP (Polyvinylpyrrolidone K90) showed that the survival rate of bacterial cells was about 8 times (78.54 ± 2.129%) under the condition of Grace 20F + PVP 1mg/ml + glutamine 20mM after 7 days of culture. In this paper, subject (II) is to confirm the existence and maintenance of a large number of eggs in a culture medium (phase difference microscope) from the initial culture to the initial culture conditions and the survival conditions in a culture medium for more than 9 months.