ウェルシュ菌産生壊死毒素(NetB)の鶏壊死性腸炎発症に関与する宿主側因子の特定

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これまでの研究で作製したLMH細胞の細胞膜に対するモノクローナル抗体の中からNetBのLMH細胞への結合を阻害する抗体を選別した。LC-MS/MSにより、この抗体が認識する分子をNetB受容体候補分子とし、受容体の特定を行った。LC-MS/MSの結果からニワトリデータベースを用いて解析し、哺乳類との相同性が低い分子を検索した。その結果、同定確率が100％で哺乳類との相同性が低かったミクロソームトリグリセリド輸送蛋白（MTTP）とトランスフェリン受容体蛋白（TFRC）を受容体の第1候補として、これらのsiRNAを用いて蛋白発現を抑制されたLMH細胞におけるNetB感受性を評価した。MTTPおよびTFRCのｍRNAを標的とするsiRNAを各5種類合成し、RT-qPCRによりｍRNA発現量を比較することで使用するsiRNAを決定した。5nMのMTTP siRNAではsiMTTP-3は33％、siMTTP-4は37％のｍRNA発現量を抑制した、TFRC-1および-2ではいずれも55％の抑制を示した。siRNA量を50nMに増量したとき、これらのsiRNAはいずれもｍRNA発現量がさらに低下したため、siRNAは50nMで以降の実験に使用した。なお、LMH細胞にこれらのsiRNAを導入したとき、細胞生存率の減少がみられなかったことから、いずれのsiRNAも細胞の生存・増殖に影響しないことが明らかとなった。それぞれのsiRNAをLMH細胞に導入し48時間後に5EC50/mlのNetBを加え、24時間反応後、MTT法により細胞の生存率を測定した。その結果、無関係のsiRNAを導入したネガティブコントロール群と比較して、いずれのsiRNA導入群で生存率に有意な違いは見られなかった。以上の結果より、今回選定したMTTPおよびTFRCはNetBの受容体でないことが明らかとなった。