ウェルシュ菌産生壊死毒素(NetB)の鶏壊死性腸炎発症に関与する宿主側因子の特定

产气荚膜梭菌产生的坏死毒素（NetB）引起鸡坏死性肠炎的宿主因素的鉴定

• 批准号: 22K06007
• 负责人: 向本 雅郁
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Osaka Metropolitan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06007/
• 关键词: NetB; 受容体; ウェルシュ菌; 小腸上皮細胞; ニワトリ; siRNA; ウエルシュ菌; 鶏; 壊死性腸炎

これまでの研究で作製したLMH細胞の細胞膜に対するモノクローナル抗体の中からNetBのLMH細胞への結合を阻害する抗体を選別した。LC-MS/MSにより、この抗体が認識する分子をNetB受容体候補分子とし、受容体の特定を行った。LC-MS/MSの結果からニワトリデータベースを用いて解析し、哺乳類との相同性が低い分子を検索した。その結果、同定確率が100％で哺乳類との相同性が低かったミクロソームトリグリセリド輸送蛋白（MTTP）とトランスフェリン受容体蛋白（TFRC）を受容体の第1候補として、これらのsiRNAを用いて蛋白発現を抑制されたLMH細胞におけるNetB感受性を評価した。MTTPおよびTFRCのｍRNAを標的とするsiRNAを各5種類合成し、RT-qPCRによりｍRNA発現量を比較することで使用するsiRNAを決定した。5nMのMTTP siRNAではsiMTTP-3は33％、siMTTP-4は37％のｍRNA発現量を抑制した、TFRC-1および-2ではいずれも55％の抑制を示した。siRNA量を50nMに増量したとき、これらのsiRNAはいずれもｍRNA発現量がさらに低下したため、siRNAは50nMで以降の実験に使用した。なお、LMH細胞にこれらのsiRNAを導入したとき、細胞生存率の減少がみられなかったことから、いずれのsiRNAも細胞の生存・増殖に影響しないことが明らかとなった。それぞれのsiRNAをLMH細胞に導入し48時間後に5EC50/mlのNetBを加え、24時間反応後、MTT法により細胞の生存率を測定した。その結果、無関係のsiRNAを導入したネガティブコントロール群と比較して、いずれのsiRNA導入群で生存率に有意な違いは見られなかった。以上の結果より、今回選定したMTTPおよびTFRCはNetBの受容体でないことが明らかとなった。

This study was conducted to identify antibodies that inhibit the binding of NetB to LMH cell membranes. In LC-MS/MS, the molecules recognized by this antibody are candidates for the NetB receptor and are specific to the receptor. The results of LC-MS/MS analysis show that the similarity between mammals and low middle molecules is very high. The results showed that the identity of mammalian cells was 100%, and the first candidate for receptor protein (TFRC) was the inhibition of protein expression by siRNA. 5 kinds of siRNA for MTTP and TFRC mRNA expression 5nM siMTTP siRNA inhibited mRNA expression by 33%, siMTTP-4 by 37%, and TFRC-1 by 55%. siRNA levels increased to 50nM and mRNA levels decreased to 50nM. The introduction of siRNA into LMH cells reduces the survival rate of cells. The survival rate of LMH cells was measured by MTT assay after 5EC50/ml and 24 hours of siRNA introduction. The results of unrelated siRNA introductions were compared with the survival rates of unrelated siRNA introductions. As a result, MTTP and TFRC are selected for NetB.