アデノウイルスタンパク質による選択的オートファジーの抑制機構の解明

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我々は非常に遺伝子導入効率が高いHEK293細胞において、内在に発現しているアデノウイルス因子E1Bによりp62が機能阻害を受け、その結果としてオートファジーが阻害され遺伝子導入効率が促進されていることを見つけた。これらの検証としてMEF細胞にE1Bを過剰発現させ遺伝子導入効率を検討したところ、p62依存的にE1Bは遺伝子導入効率を促進した。さらに、アデノウイルス感染細胞ではE1BとE4領域のタンパク質が相互作用しアポトーシスやアデノウイルスmRNAの輸送を制御していることから、p62がE1Bだけでなく他のアデノウイルスタンパクや宿主タンパク質と複合体を形成し、協調的な制御を行なっているのではないかと考えた。これらを確認するため、まずE1Bとp62の結合について、双方の結合ドメインを生化学的手法にて同定した。このp62のドメインを用い、MEF細胞、HeLa細胞などの細胞抽出液にて免疫沈降を行い、これまでに得られているHEK293細胞におけるp62結合タンパク群との比較をおこなった。E1BのみならずE4タンパク質の過剰発現では相乗的に遺伝子導入効率を促進すること、一方でp62のドメインに結合するペプチドを添加すると、HEK293細胞での遺伝子導入効率が大きく抑制されることから、p62とE1Bとの結合が主たる機能制御領域であると考えられた。すなわちこの結合を阻害することにより、p62によるウイルス感染抑制機能を制御できると予想される。上記の阻害ペプチドが二つのタンパク結合を阻害する指標になることから、p62-E1B間の相互作用を利用した、阻害程度を定量化する化合物スクリーニングシステムの開発を開始した。初年度として、それぞれのタンパクに大きさの異なるNano Luc断片を結合させたベクターの作製を行った。