RNAアプタマーを利用したU2 snRNPの「ゆるい」ブランチ部位認識機構の解明

使用RNA适体阐明U2 snRNP的“松散”分支位点识别机制

• 批准号: 22K06105
• 负责人: 桑迫 香奈子
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Musashino University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06105/
• 关键词: mRNAスプライシング; U2 snRNP; RNAアプタマー; pre-mRNAスプライシング

U2 snRNPは，mRNA前駆体のスプライシングにおいて，イントロン上のブランチ部位を認識して結合し，スプライシング反応の活性中心を形成する。ヒトでは，ブランチ部位とされる配列は複数あるが，これら複数のRNA配列をどのようにしてU2 snRNPが認識しているのかは未知である。本研究では，このU2 snRNPによる認識を「ゆるい」と定義して，この特徴的なRNA認識機構をRNAアプタマーを利用して解明する。本研究で利用するアプタマーがスプライシングに与える影響を確認するため，インビトロでのスプライシングアッセイ系の作製を試みた。基質となるmRNA前駆体は，T7 RNAポリメラーゼによる転写反応によって合成するため，鋳型のDNAをプラスミドの形で精製し，制限酵素処理によりRun-offさせられる形とした。現在，これを用いて転写反応を行い，その産物の確認を行っている。スプライシング反応を起こすために必要なスプライシング因子は，核抽出物を用いる。いくつかの文献で市販の核抽出物が使われているため，同じものを購入して利用する予定である。スプライシング制御因子がU2 snRNPに結合することで，選択的スプライシングに影響を与えることが示唆されている。そこで特定の制御因子に注目し，大腸菌を宿主とした発現系の構築を試みたが，成功しなかった。今後はこれを継続させて，無細胞タンパク質合成系の利用を試みる予定である。また，全長ではなく，相互作用に関与する部位に注目して発現系を構築することも検討する。

U2 snRNPは, pre-mRNA 槆体のスプライシングにおいて, イントロン上のThe ブランチ parts are recognized and combined, and the スプライシング reaction and active center are formed. U2 snRNP is unknown. In this study, the recognition mechanism of U2 snRNP was recognized and defined, and the specific RNA recognition mechanism of U2 snRNP was used to explain the understanding of RNA. This study has confirmed the impact of the use of するアプタマーがスプライシングに and えるるため, インビトロでのスプライシングアッセイ Department の产产をtrialみた. Matrix となるmRNA pre-mRNA body は, T7 RNA ポリメラーゼによる転WRITE RESULTS によって SYNTHETIC するため, 鋳-type のDNA をプラスミドのshapedでRefinedし, restriction enzyme treatmentによりRun-offさせられるshapedとした. Now, これを uses いて転 to write 応を行い, and そのproductのconfirmationを行っている. The スプライシングシングを起こすためにnecessaryなスプライシングfactorは, the nuclear extract is used いる.いくつかの Documents and で Commercial Nuclear Extracts が われているため, same as じものを Purchase して Utilize する Predetermined である.スプライシングControl FactorがU2 snRNP is a combination of the することで, the selected スプライシングにeffect を and the えることが Shows the されている.そこでSpecific のcontrol factor にattentionし, coliform をhost とした発existing system のconstruct をtest みたが, success しなかった. In the future, the use of the cell-free biomass synthesis system will be tested and determined. It's full length, it's full length, it's about the interaction with the parts, it's the focus of attention, it's the structure of the system, it's the structure of it.