RNAアプタマーを利用したU2 snRNPの「ゆるい」ブランチ部位認識機構の解明

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U2 snRNPは，mRNA前駆体のスプライシングにおいて，イントロン上のブランチ部位を認識して結合し，スプライシング反応の活性中心を形成する。ヒトでは，ブランチ部位とされる配列は複数あるが，これら複数のRNA配列をどのようにしてU2 snRNPが認識しているのかは未知である。本研究では，このU2 snRNPによる認識を「ゆるい」と定義して，この特徴的なRNA認識機構をRNAアプタマーを利用して解明する。本研究で利用するアプタマーがスプライシングに与える影響を確認するため，インビトロでのスプライシングアッセイ系の作製を試みた。基質となるmRNA前駆体は，T7 RNAポリメラーゼによる転写反応によって合成するため，鋳型のDNAをプラスミドの形で精製し，制限酵素処理によりRun-offさせられる形とした。現在，これを用いて転写反応を行い，その産物の確認を行っている。スプライシング反応を起こすために必要なスプライシング因子は，核抽出物を用いる。いくつかの文献で市販の核抽出物が使われているため，同じものを購入して利用する予定である。スプライシング制御因子がU2 snRNPに結合することで，選択的スプライシングに影響を与えることが示唆されている。そこで特定の制御因子に注目し，大腸菌を宿主とした発現系の構築を試みたが，成功しなかった。今後はこれを継続させて，無細胞タンパク質合成系の利用を試みる予定である。また，全長ではなく，相互作用に関与する部位に注目して発現系を構築することも検討する。