中性子回折を用いたSIRT5の脱スクシニル反応におけるプロトン移動経路解明

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変異体SIRT5の脱スクシニル化活性の測定：SIRT5の活性に重要とされるアミノ酸に変異を導入したSIRT5(Q140L, N141V, H158M)の機能解析を行うことを目的とし、変異導入した遺伝子合成を行い、これを基にSIRT5変異体について 遺伝子組み換え大腸菌による発現、大腸菌破砕によりタンパク質の抽出および精製を行なった。これらの変異体について、基質結合と酵素反応におけるQ140,N141,H158の役割を明確にするために、ミカエリス-メンテン解析によってKmとKcatを得、野生型と比較することを試みた。現在、解析を進めている。中性子回折測定用大型結晶育成：中性子構造解析のための大型結晶育成を目的として、野生型SIRT5について、遺伝子組み換え大腸菌による発現、大腸菌破砕によりタンパク質の抽出および精製方法の確立を行ない、SIRT5の発現タンパク質の濃縮により、23.2mg/mLのタンパク質溶液を得ることができた。しかしながら、研究代表者の所属における実験環境に不備が生じたため、中性子構造解析の大型結晶育成のための結晶化条件検索や実際の大型結晶化に用いるのに十分な大量のタンパク質精製には至らなかった。結晶化に必要な試薬として、スクシニル化リシンscuprx1（配列：SKEYFS{Lys(suc)}Q K）のペプチド合成を行なった。大型結晶育成のためのタンパク質大量精製とそれを用いた結晶化条件の検索を今後進める予定である。中性子回折データ精度向上法開発：iBIXで得られる白色中性子回折データは単色よりデータ精度が低い傾向にある。波長依存性の対して適切に補正する新たな方法を開発することを目的とした初期検討を実施した。現在検討を継続している。