膜結合型酵素によるグレリン活性化機構の解明

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本年度は、GOAT発現系の確立を試みた。発現系候補としてまず、これまでグレリン受容体の発現などで活用してきたBac-to-Bac system (invitorogen) を選択した。ヒトGOAT遺伝子を組込んだバキュロウイルスを作製して、昆虫細胞であるSf9細胞でGOATを発現させた。その後、GOATに付与したGFPを指標にしてCell analyzerによって発現量を確認したが、発現量は著しく低かった。そこで感染量や感染時間を変えながら発現を試みたが、発現量を増加させることができなかった。またわずかに発現したGOATをHisタグ精製してゲル濾過クロマトグラフィーに供したが、GOATのピークを確認することができなかった。この理由として、Bac-to-Bac systemがGOATの発現に適していない可能性が考えられた。そこで、発現系を浮遊系哺乳類細胞であるExpi293 system (invitrogen) に変更した。細胞には、テトラサイクリン系抗生剤の添加によって発現が誘導される様に遺伝子改変されているExpi293F inducible細胞を用いた。Transfectionの条件を検討ののち、50 mLの小スケールでGOATを発現させるとGFPの蛍光が確認できた。そこでこの発現タンパク質をNi精製して、蛍光クロマトグラフィーに供した。しかしながらGOATのピークを確認することはできなかった。