脱リン酸化を介した神経細胞カルシウムシグナル全貌解明のための基盤研究

通过去磷酸化阐明神经元钙信号完整情况的基础研究

• 批准号: 22K06139
• 负责人: 千村 崇彦
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06139/
• 关键词: シグナル伝達; 神経可塑性; カルシウム

「カルシウムイオンがどのように神経可塑性を制御するのか?」この根源的な問いに答えるため、神経細胞に発現する蛋白質に着目し、その分子的特性を調節するリン酸化状態、特にカルシウム依存的に起こる脱リン酸化反応の制御機構を解明する。新規に発見した神経細胞における脱リン酸化反応と、それをin vitroで再現する独自に構築したin vitro脱リン酸化反応系を用い、以下の２点を主たる研究の柱として解析を進めている。(1)神経細胞に発現している機能未知分子として我々が独自に単離した新規蛋白質UF1が前述の脱リン酸化制御に果たす役割を明らかにすること、(2)当該脱リン酸化反応の標的となる新規な基質蛋白質を、質量分析などのプロテオミクス解析を用いて網羅的に探索し、脱リン酸化反応の全体像を明らかにすること。2022年度の進捗状況は以下の通りである。(1)UF1の生化学的特性の解析を行うため、大腸菌リコンビナント蛋白質精製条件の確立、及び生化学的アッセイ法の確立を重点的に進めた。リコンビナントUF1をGST融合蛋白質として精製条件を確立した。また、溶出に用いた還元型グルタチオン、及びGST蛋白質それ自体は脱リン酸化反応に影響を与えないことを確認し、GST融合蛋白質存在下でのin vitro脱リン酸反応の条件を確立した。当該条件においてGST-UF1の脱リン酸化反応に対する影響を計測したところ、UF1には脱リン酸化抑制活性があることが判明した。この発見は、神経細胞におけるシグナル伝達系の理解において極めて重要な知見である。(2)脱リン酸化反応の標的となる新規蛋白質の網羅的解析を進めるため、質量分析に供するサンプルの調製方法、蛋白質量の検討を進めた。マウス脳抽出液を用いる方法と、神経細胞の初代培養細胞の抽出液を用いる方法を比較し、前者の方が質的に優れた方法であることを確認した。

“钙离子如何调节神经可塑性？”为了回答这个基本问题，我们将重点关注在神经元中表达的蛋白质，并阐明调节其分子特性的磷酸化机制，尤其是钙依赖性的去磷酸化反应。使用新发现的神经元中的去磷酸化反应以及在体外繁殖这些反应的独特构建的唯一体外脱磷酸化反应系统，我们正在使用以下两个主要研究点进行分析。 （1）为了阐明新型蛋白UF1的作用，我们独立地将其独立于神经元中表达的未知功能分子隔离，在上述脱磷酸化调节中发挥作用，（2）全面搜索新型底物蛋白，是使用质量分析的质量分析量的质量分析，是素质性分析的量子，是素质性分析的范围，并构成质量分析的质量分析，并绘制质量分析的量表，并且 反应。 2022财政年度的进展如下：（1）为了分析UF1的生化特性，我们专注于建立净化大肠杆菌重组蛋白并建立生化测定的条件。使用重组UF1作为GST融合蛋白建立纯化条件。此外，已经证实，用于洗脱的谷胱甘肽还原和GST蛋白本身不会影响去磷酸化反应，以及在存在GST融合蛋白存在下体外去磷酸化反应的条件。测量了GST-UF1对上述条件下去磷酸化反应的影响，并发现UF1具有去磷酸化的抑制活性。这一发现是理解神经元信号系统的关键发现。 （2）为了对新型蛋白质进行全面分析，这些蛋白质是去磷酸化的靶标，我们研究了要经过质谱和蛋白质量的样品的制备方法。我们比较了一种使用小鼠脑提取物与原代培养神经元细胞提取物的方法，并证实了前者是质量上更好的方法。