脱リン酸化を介した神経細胞カルシウムシグナル全貌解明のための基盤研究

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「カルシウムイオンがどのように神経可塑性を制御するのか?」この根源的な問いに答えるため、神経細胞に発現する蛋白質に着目し、その分子的特性を調節するリン酸化状態、特にカルシウム依存的に起こる脱リン酸化反応の制御機構を解明する。新規に発見した神経細胞における脱リン酸化反応と、それをin vitroで再現する独自に構築したin vitro脱リン酸化反応系を用い、以下の２点を主たる研究の柱として解析を進めている。(1)神経細胞に発現している機能未知分子として我々が独自に単離した新規蛋白質UF1が前述の脱リン酸化制御に果たす役割を明らかにすること、(2)当該脱リン酸化反応の標的となる新規な基質蛋白質を、質量分析などのプロテオミクス解析を用いて網羅的に探索し、脱リン酸化反応の全体像を明らかにすること。2022年度の進捗状況は以下の通りである。(1)UF1の生化学的特性の解析を行うため、大腸菌リコンビナント蛋白質精製条件の確立、及び生化学的アッセイ法の確立を重点的に進めた。リコンビナントUF1をGST融合蛋白質として精製条件を確立した。また、溶出に用いた還元型グルタチオン、及びGST蛋白質それ自体は脱リン酸化反応に影響を与えないことを確認し、GST融合蛋白質存在下でのin vitro脱リン酸反応の条件を確立した。当該条件においてGST-UF1の脱リン酸化反応に対する影響を計測したところ、UF1には脱リン酸化抑制活性があることが判明した。この発見は、神経細胞におけるシグナル伝達系の理解において極めて重要な知見である。(2)脱リン酸化反応の標的となる新規蛋白質の網羅的解析を進めるため、質量分析に供するサンプルの調製方法、蛋白質量の検討を進めた。マウス脳抽出液を用いる方法と、神経細胞の初代培養細胞の抽出液を用いる方法を比較し、前者の方が質的に優れた方法であることを確認した。