光活性化cAMP産生酵素の高時間分解能活性計測を基盤とした光遺伝学ツールの創製

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本研究では、cAMP依存的に開閉するイオンチャネル（CNGチャネル）を利用して、光活性化アデニル酸シクラーゼ（PAC）の特性の調整機構を解明し、細胞機能の光操作に適した新規PAC改変体群を創製することを目的としている。本年度は、PACが産生するcAMP量を捉えるのに適したCNGチャネルの選定を行った。詳細を下記に記す。CNGチャネルの一種であるHCN2チャネルとSthKチャネルのcAMP感受性を比較した。これらのCNGチャネルをアフリカツメガエルの卵母細胞にそれぞれ発現させ、細胞内cAMP濃度の変化に伴うチャネル電流の変化を計測した。HCN2チャネルを発現させた卵母細胞では、フォルスコリンの添加または共発現させたPACへの光刺激によってcAMP産生を促さなくてもチャネル電流が捉えられ、これらの刺激によりcAMP量を高めてもチャネル電流に変化はなかった。一方、SthKチャネルでは、フォルスコリンの添加前後でチャネル電流に変化が見られた。ELISA法によるcAMP濃度の測定により、卵母細胞内には元々約1 μMのcAMPが存在していたことから、HCNチャネルは1 μM程度のcAMPで完全に活性化されると考えられる。一方、SthKチャネルが活性化された条件での細胞内cAMP濃度は200 μM以上であったことから、SthKチャネルは数100 μM以上のcAMPが活性化に必要なことがわかった。これらのことから、PACの特性を調べる際、活性が低い、つまり産生されるcAMP量が少ない場合にはHCN2チャネルを、活性が高い場合にはSthKチャネルを用いれば、特性を捉えられることが示唆された。