後葉ホルモン受容体V2aRの分子・機能進化の再現

再现后叶激素受体 V2aR 的分子和功能进化

基本信息

批准号：
22K06296
负责人：
山口陽子
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Shimane University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

下垂体後葉ホルモンは、腎臓に発現する受容体V2aRを介して強力な抗利尿作用を発揮し、乾燥した陸上環境に適応する上で必要不可欠な役割を果たす。V2aRとその祖先型分子であるV2bRはシグナリング特性が異なり、前者はcAMPを、後者はCa2+を用いた情報伝達を行う。この違いは、両者が共役するGタンパク質の種類に起因する。一般的に、V2aR（cAMPタイプ）はGsと、V2bRを含むその他の後葉ホルモン受容体（Ca2+タイプ）はGqと共役するとされる。本研究は、遺伝子工学的手法を駆使してV2bRからV2aRへの進化を分子～個体レベルで再現し、V2aRの成立過程ならびにそれが後葉ホルモン系の機能進化に与えた影響を解明することを目指す。研究の第一段階は、V2aRとV2bRそれぞれのシグナリング特性を決定するアミノ酸配列モチーフを特定することである。当初の予定では、メダカV2aRとV2bRの配列を一部入れ替えたキメラ受容体を作成し、そのGタンパク質選択性について、FRET（Gs）または電気生理学をベースとした手法（Gq）で検証することとしていた。しかし研究の過程で野生型受容体の機能特性を精査する必要が生じたため（下記参照）、そちらを優先した。キメラ受容体に先んじて野生型受容体のGタンパク質選択性を検証したところ、Gsとの共役能についてはV2aRがV2bRに勝り、先行研究と一致する結果が得られた。一方で、V2bRのGq応答性は極めて低いことが示された。比較のためにネッタイツメガエルの受容体も解析に加えたが、同様の結果となった。すなわち、V2bRのCa2+シグナリングは従来考えられていたGqではなく、別のGタンパク質によって引き起こされる可能性が示唆された。なお、in vitro実験におけるGタンパク質選択性の解析は、生理学研究所の共同利用研究制度により実施した。

后坐骨激素通过在肾脏中表达的受体V2AR发挥有效的抗利尿作用，并在适应干地环境中起着至关重要的作用。 V2AR及其祖先分子V2BR具有不同的信号传导特性，前者使用CAMP和后者使用Ca2+。这种差异是由于G蛋白的类型均引起的。通常，V2AR（CAMP类型）被认为与GS和其他含有V2BR（Ca2+类型）的后叶激素受体（Ca2+类型）耦合。这项研究旨在使用基因工程方法在分子至个体水平上重现V2BR到V2AR的演变，并阐明V2AR的建立过程及其对后叶激素系统功能演化的影响。研究的第一步是鉴定分别确定V2AR和V2BR的信号传导特性的氨基酸序列基序。最初的计划是创建一个嵌合受体，该嵌合受体部分交换了Medaka V2AR和V2BR的序列，并使用FRET（GS）或基于电生理学的方法（GQ）验证其G蛋白选择性。但是，由于研究过程需要详细检查野生型受体的功能特性（见下文），因此优先考虑。当我们在嵌合受体之前验证野生型受体的G蛋白选择性时，V2AR就其与GS结合的能力超过了V2BR，结果与先前的研究一致。另一方面，证明V2BR的GQ响应能力极低。为了进行比较，还将骨骼青蛙的受体添加到分析中，结果相似。也就是说，V2BR中的Ca2+信号传导可能是由另一种G蛋白而不是常规思想GQ引起的。此外，在生理研究所的联合使用研究系统下，对G蛋白选择性进行了分析。