長鎖非コードRNAによるTLS相分離を介した新規の転写制御機構の解明

阐明长非编码RNA TLS 相分离介导的新型转录控制机制

基本信息

批准号：
22K06904
负责人：
黒川理樹
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Saitama Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06904/
关键词：
長鎖非コードRNA TLS FUS 相分離 ALS 天然変性領域 IDR 転写制御 RNA結合タンパク質 TLS/FUS 神経変性疾患

项目摘要

本研究の核心をなす問いは、「lncRNAはTLSの相分離に作用し転写を制御するのか」である。これに答えるために目的を設定した。目的は、相分離により形成される液滴に作用して転写を抑制するlncRNAを見いだすことである。これにより、新規の転写抑制機構を示すことになる。この目的を達成するために、2022年度はTLSに結合するlncRNAの検出法の確立を目指した。具体的には、GST-TLSにヒトHeLa細胞総RNAを結合させ、lncRNAを検出する方法を確立した。まず、大腸菌発現のGST-TLSを調製して、内因性の大腸菌RNAをMicrococcal Nuclease処理で除去した。このGST-TLSにHeLa細胞総RNAを結合させた。結合RNA画分から、RNA精製キットでTLS結合RNAを調製した。このTLS結合RNAから相補的なCyanine3標識のcRNAを合成し、ヒトlncRNAマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせた。シグナル強度をスキャナーで測定した。出発物質であるHeLa細胞総RNAから、精製されたGST-TLS結合RNAの中でシグナルが2倍以上に上昇したRNA配列は1700種類以上が見いだされた。これらの配列で、10倍以上増加したRNAが50件ほど、20倍以上が10件以上となった。次年度は、これらのlncRNAが実際にTLSに結合し、相分離制御作用を有するかを検証していく。この成果は、相分離に作用して転写を抑制する新規のlncRNAを同定することになる。

这项研究的关键问题是：“ LNCRNA对TLS的相位分离作用并调节转录吗？”我设定了一个目标来回答这个问题。目的是找到对通过相分离形成的液滴作用以抑制转录的作用。这表明一种新型的转录抑制机制。为了实现这一目标，在2022财年，我们旨在建立一种检测与TLS结合的LNCRNA的方法。具体而言，通过结合人类HeLa细胞与GST-TLS的总RNA来确定检测LNCRNA的方法。首先，制备具有大肠杆菌表达的GST-TL，并通过微局球核酸酶处理去除内源性大肠杆菌RNA。总HeLa细胞RNA与该GST-TL结合。使用RNA纯化试剂盒从结合的RNA分数制备TLS结合RNA。从该TLS结合RNA合成互补的氰氨基3标记的CRNA，并杂交与人lncRNA微阵列。使用扫描仪测量信号强度。从起始材料总RNA RNA中发现了超过1,700个具有信号的RNA序列，其增加了两倍以上的高度是纯化的GST-TLS结合RNA。这些序列导致大约50个RNA增加了10次以上，超过20次，或超过10次。在明年，我们将检查这些LNCRNA是否真的与TLS结合并具有相位分离控制效果。该结果将确定对相位分离和抑制转录作用的新型LNCRNA。