自然免疫型T細胞分化を担う核内リン酸化酵素の基質同定と転写プログラム誘導機構

鉴定负责先天免疫 T 细胞分化和转录程序诱导机制的核激酶底物

• 批准号: 22K07117
• 负责人: 石川 絵里
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07117/
• 关键词: 自然免疫型T細胞分化; 転写プログラム; セリンスレオニンキナーゼ; 自然免疫型T細胞

自然免疫型T細胞に属するインバリアントナチュラルキラーT (iNKT) 細胞や粘膜関連インバリアントT (MAIT) 細胞の胸腺での分化機構は、従来のT細胞に比べ未だ不明な点が多い。また、自然免疫T細胞の分化には転写因子PLZFが必須であるが、T細胞受容体からPLZF発現に至る分子機構の詳細は明らかになっていない。これまでの研究で、プロテインキナーゼD (PKD)のCD4-Cre TgによるT細胞特異的欠損マウスにおいて、従来のT細胞は正常であるものの、自然免疫T細胞のみが消失することを見出した。この消失はPLZF Tgの導入により回復し、PKDがPLZFの発現誘導に寄与することが示唆された。本研究では、自然免疫T細胞のみが特異的に消失するユニークなPKD欠損マウスを用い、PKDの基質分子を同定し、リン酸化の意義を明らかにすることで、自然免疫T細胞分化に至る転写プログラムの誘導機構を明らかにすることを目的としている。これまでの研究によりiNKT細胞においてPKDは、TCR刺激により活性化することを見出している。また、iNKT細胞におけるPKD基質として転写因子を同定済みであることから、当該転写因子がiNKT細胞で特異的に制御する可能性のある遺伝子をクロマチン免疫沈降ChIP-seqにより解析した。その結果、当該転写因子のPLZF遺伝子上流への結合が認められたため、ChIP-qPCRおよびルシフェラーゼアッセイを行い、PLZFの転写制御に寄与するか否か検討を行った。さらに、PKDによるリン酸化が基質分子にどのような機能変化をもたらすかを調べるため、TurboID融合基質コンストラクトをiNKT細胞株に導入し、BioID (近位依存性ビオチン化) 法を用いて、リン酸化により制御される相互作用分子の同定を試みた。

与常规T细胞相比，属于天生免疫T细胞的不变天然杀手T（INKT）细胞（INKT）细胞和与天生免疫T细胞的粘膜相关的T（MAIT）细胞的分化机制仍然未知。此外，尽管转录因子PLZF对于分化先天免疫T细胞至关重要，但尚未揭示从T细胞受体到PLZF表达的分子机制的细节。先前的研究发现，在特别缺乏蛋白激酶D（PKD）（PKD）的小鼠中，CD4-CRE TG，只有先天免疫T细胞消失，尽管常规T细胞是正常的。通过引入PLZF TG恢复了这种消失，这表明PKD有助于诱导PLZF表达。这项研究旨在通过使用独特的PKD缺陷型小鼠来阐明转录程序的诱导机制，从而导致先天免疫T细胞分化，其中仅通过识别PKD的底物分子并阐明磷酸化的重要性，从而识别植酸分子，从而特别废除了先天性免疫T细胞。先前的研究发现，PKD是通过inkt细胞中TCR刺激激活的。此外，由于转录因子已被鉴定为inkt细胞中的PKD底物，因此通过染色质免疫沉淀芯片seq分析了可能特异性调节inkt细胞转录因子的基因。结果，观察到转录因子与PLZF基因上游的结合，并进行了芯片-QPCR和荧​​光素酶测定，以确定它是否有助于PLZF的转录调节。此外，为了研究PKD的磷酸化如何导致底物分子的功能变化，我们将涡轮融合底物构建物引入了Inkt细胞系中，并试图使用生物依赖性生物素化的方法来识别磷酸化控制的相互作用分子。