PDGFRA遺伝子変異の抗がん剤感受性マップの作製

PDGFRA基因突变抗癌药物敏感性图谱的制作

• 批准号: 22K07305
• 负责人: 濱田 大治
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Kagoshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07305/
• 关键词: ゲノム編集; 飽和ゲノム編集; PDGFRA遺伝子; 意義不明変異; がん遺伝子

本年度は本研究計画の根本をなす「一倍体細胞株を用いたPDGFRA遺伝子の飽和ゲノム編集」について検討を行った。まず、用いる一倍体細胞株（HAP-1）のゲノム編集方法で用いるプラスミド、Cas9蛋白質およびドナーDNAであるssODNsのトランスフェクションの検討を行った。本細胞株は遺伝子導入が非常に困難な細胞株であると言われており、効率的な導入が飽和ゲノム編集の成否を左右することが想定される。様々な導入方法を検討した結果、エレクトロポレーションによりCas9蛋白質を導入しゲノム編集を行う方法が最も効率的であることを見出した。その上で、導入に用いるCas9蛋白質およびssODNの最適化を行った。当初の研究計画ではゲノム編集はプライム編集により行うとされていたが、検討の結果から十分な編集効率を得ることができないことが判明した。そこで編集方法を研究計画で示した代替案である通常のCas9 nucleaseを用いて飽和ゲノム編集に切り替え、さらなる検討を行った。その結果、PDGFRA遺伝子のエクソン10における小規模な飽和ゲノム編集（9塩基連続の網羅的な一塩基置換）を行うことが可能であった。この飽和ゲノム編集が領域特異的なものでないことを確認するため、他のエクソン領域についても検討を順次行っている。今のところ、エクソン5でも同様に飽和ゲノム編集が可能であったことを確認しており、確立した実験方法は普遍的に飽和ゲノム編集が可能であることを示している。

This year, we conducted a research project on the basis of the "saturation compilation of PDGFRA genes in haploids." A method for the development of a novel haplosome cell line (HAP-1) was developed using the expression of Cas9 protein and DNA. This cell line is very difficult to introduce into the cell line. It is difficult to introduce into the cell line at a high rate. It is difficult to determine whether the cell line is saturated or not. The results of the study on the method of introducing Cas9 protein were as follows: Cas9 protein and ssODN are optimized for use in the introduction of the protein. The original research plan made it clear that both local compilation and local compilation were necessary, and the results of the investigation made it clear that the compilation efficiency was very high. The method of compilation is studied and replaced by the usual Cas9 nucleotide. As a result, PDGFRA gene can be used for small scale saturation compilation (9-base substitution). This saturation group is composed of domain-specific elements, which are identified and discussed in sequence. Now, we can confirm that it is possible to establish a universal saturation system.