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疾患特異的シード依存性タウ凝集におけるグリア細胞の機序解明と臨床応用

胶质细胞疾病特异性种子依赖性tau聚集机制的阐明及临床应用

基本信息

批准号：
22K07428
负责人：
本井ゆみ子
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Juntendo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07428/
关键词：
タウ蛋白シード依存性凝集グリア細胞ストレイン

项目摘要

疾患特異的シード依存性凝集を利用した血液マーカー開発をめざし、第一段階としてアルツハイマー病(AD)脳シードを用い野生型タウリコンビナントを基質とするreal-time quaking induced conversion assay (RT-QuIC)による定量法実験系の最適化を行った。昨年度までTau基質の濃度を(100μM～5μM)で行っていたが、蛍光度は上昇するが、電顕でタウfilamentが確認できないことから、チオフラビン蛍光の上昇はタウ蛋白がβシート構造を形成し線維化したことを表していないと考えられた。そこで、今回は、ビーズの有無、NaCl, MgCl2などの塩の除去,還元剤変更、バッファー変更、Tau 基質濃度の変更、蛍光度だけでなく電顕観察も併用した。最適条件下では5時間頃より蛍光度が上昇し48時間まで継続、電子顕微鏡で径12.5nmのタウ線維が確認できた。この条件にてアルツハイマー病脳seedを1000倍希釈まで可能であったため、タウ凝集抑制変異Δ368タウを基質としたところ8時間より蛍光度は上昇し、24時間をピークとして低下した。電顕による線維は径20nm以上と太く交叉線維が多く、明らかにヒトADでみられるタウ線維とは異なっており、Δ368タウはADの診断に有用な可能性が示唆された。疾患特異的シード依存性凝集を利用した薬剤探索についてはアルツハイマー病脳をシードとして野生型タウを過剰発現させた神経芽細胞株に添加し, 48時間培養する系を用いた。不溶性タウを減少させることを指標として700化合物のスクリーニングを行った。最初のスクリーニングで180化合物に絞られ、LDHアッセーにより細胞死をおこすものを除外した。次に可溶性タウを減少させるものも除外し38種に絞られ、最後に3症例の脳をシードとし、最も効果のある薬剤4種類に絞りこみ動物実験を行った。

Disease-specific aggregation is utilized to optimize the real-time quaking induced conversion assay (RT-QuIC) for the first stage of the process. The concentration of Tau matrix (100μM~5μM) increased in the past year, and the fluorescence increased in the past year. For example, the presence or absence of trace elements, NaCl, MgCl2, etc., the change of trace elements, the change of Tau matrix concentration, and the change of light intensity are used together. Under the optimum conditions, the luminosity increased after 5 hours and the linear dimension was confirmed after 48 hours by electron microscope with a diameter of 12.5 nm. The condition is 1000 times higher than the original condition. The diameter of the line is more than 20nm, and the cross line dimension is more than 20nm. The line dimension of the line is different from that of the line dimension of the line dimension. The diagnosis possibility of the line dimension is indicated. The disease-specific dependent aggregation was explored and the wild-type cells were developed. The cells were cultured for 48 hours. Insoluble compounds are reduced by 700%. The first batch of 180 compounds was released, and the second batch was released. In addition to the 38 kinds of soluble drugs, the last three kinds of soluble drugs were found in the four kinds of soluble drugs.