疾患特異的シード依存性タウ凝集におけるグリア細胞の機序解明と臨床応用

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疾患特異的シード依存性凝集を利用した血液マーカー開発をめざし、第一段階としてアルツハイマー病(AD)脳シードを用い野生型タウリコンビナントを基質とするreal-time quaking induced conversion assay (RT-QuIC)による定量法実験系の最適化を行った。昨年度までTau基質の濃度を(100μM～5μM)で行っていたが、蛍光度は上昇するが、電顕でタウfilamentが確認できないことから、チオフラビン蛍光の上昇はタウ蛋白がβシート構造を形成し線維化したことを表していないと考えられた。そこで、今回は、ビーズの有無、NaCl, MgCl2などの塩の除去,還元剤変更、バッファー変更、Tau 基質濃度の変更、蛍光度だけでなく電顕観察も併用した。最適条件下では5時間頃より蛍光度が上昇し48時間まで継続、電子顕微鏡で径12.5nmのタウ線維が確認できた。この条件にてアルツハイマー病脳seedを1000倍希釈まで可能であったため、タウ凝集抑制変異Δ368タウを基質としたところ8時間より蛍光度は上昇し、24時間をピークとして低下した。電顕による線維は径20nm以上と太く交叉線維が多く、明らかにヒトADでみられるタウ線維とは異なっており、Δ368タウはADの診断に有用な可能性が示唆された。疾患特異的シード依存性凝集を利用した薬剤探索についてはアルツハイマー病脳をシードとして野生型タウを過剰発現させた神経芽細胞株に添加し, 48時間培養する系を用いた。不溶性タウを減少させることを指標として700化合物のスクリーニングを行った。最初のスクリーニングで180化合物に絞られ、LDHアッセーにより細胞死をおこすものを除外した。次に可溶性タウを減少させるものも除外し38種に絞られ、最後に3症例の脳をシードとし、最も効果のある薬剤4種類に絞りこみ動物実験を行った。