微小流路を連結した灌流培養系によるα-シヌクレイン線維化条件の探索

パーキンソン病は中脳黒質のドーパミン神経細胞が選択的に変性・脱落する晩発性の神経変性疾患である。患者の脳には、α-シヌクレインがリン酸化された凝集体（レビー小体）が現れるが、発症原因は依然として不明である。申請者は、パーキンソン病患者のiPS細胞から誘導したドーパミン神経細胞であっても、α-シヌクレインの凝集体はみられるものの、患者にみられるレビー小体とは別であることを確認している。レビー小体の生成には、線維化したα-シヌクレインが必要であると考えられているが、α-シヌクレインが細胞内で線維化するメカニズムは未解明であり、パーキンソン病の病態解明研究は進んでいない。本研究では、ドーパミン神経細胞を継続的にストレス状態に晒すために、微小流路を連結した灌流培養法を構築することで、α-シヌクレインの線維化メカニズムを明らかにすることを目的とする。今年度は、パーキンソン病患者iPS細胞を理研セルバンクから新規に購入し、十分量の凍結細胞ストックを作製後、mRNA導入法を用いたドーパミン神経細胞作製法を用いて、パーキンソン病患者iPS細胞および健常人iPS細胞からドーパミン神経細胞を作製した。35日間の神経分化誘導後に細胞免疫染色を行った結果、いずれのiPS細胞から作製した神経細胞もドーパミン神経細胞のマーカーであるチロシン水酸化酵素を発現することが確認された。しかし、レビー小体の構成要素であるα-シヌクレインを検出したところ、パーキンソン病患者iPS細胞から作製したドーパミン神経細胞であってもα-シヌクレインの凝集体が認められず、従来の培養法ではパーキンソン病の病態が再現されないことが示唆された。

パーキンソン病は中脳黒質のドーパミン神経細胞が選択的に変性・脱落する晩発性の神経変性疾患である。患者の脳には、α-シヌクレインがリン酸化された凝集体（レビー小体）が現れるが、発症原因は依然として不明である。申請者は、パーキンソン病患者のiPS細胞から誘導したドーパミン神経細胞であっても、α-シヌクレインの凝集体はみられるものの、患者にみられるレビー小体とは別であることを確認している。レビー小体の生成には、線維化したα-シヌクレインが必要であると考えられているが、α-シヌクレインが細胞内で線維化するメカニズムは未解明であり、パーキンソン病の病態解明研究は進んでいない。本研究では、ドーパミン神経細胞を継続的にストレス状態に晒すために、微小流路を連結した灌流培養法を構築することで、α-シヌクレインの線維化メカニズムを明らかにすることを目的とする。今年度は、パーキンソン病患者iPS細胞を理研セルバンクから新規に購入し、十分量の凍結細胞ストックを作製後、mRNA導入法を用いたドーパミン神経細胞作製法を用いて、パーキンソン病患者iPS細胞および健常人iPS細胞からドーパミン神経細胞を作製した。35日間の神経分化誘導後に細胞免疫染色を行った結果、いずれのiPS細胞から作製した神経細胞もドーパミン神経細胞のマーカーであるチロシン水酸化酵素を発現することが確認された。しかし、レビー小体の構成要素であるα-シヌクレインを検出したところ、パーキンソン病患者iPS細胞から作製したドーパミン神経細胞であってもα-シヌクレインの凝集体が認められず、従来の培養法ではパーキンソン病の病態が再現されないことが示唆された。