細胞骨格動態制御によるALS病態改善の試み

2022年度はRepulsive guidance molecule A(RGMa)抗体を投与したALSモデルマウスにおける、細胞骨格動態の検証を行った。ファロイジンとDNaseⅠによる免疫染色によりアクチン重合の程度の可視化を行ったところ、ALSモデルマウスにおいてアクチンの脱重合が誘導され、RGMa抗体投与によりそれが改善することが示された。またwestern boltをおこなうことで、RGMaシグナルの活性化の程度を定量化した。RGMaは細胞膜上のNeogeninと結合することで、Rhoを中心としたsmall GTPaseの経路を活性化することが知られている。今回、その下流であるSMADやProfilin、Cofilinの活性化を確認した所、ALSモデルマウスにおいてアクチン重合を阻害するCofilinが活性化しており、RGMa抗体投与によりそれが改善することが確認された。一方でもともと予想されていた、ALSモデルマウスにおけるtubulinの脱重合に関しては、CRMP2などの上流のシグナルをwestern blotで定量化したが、メカニズムを推定できるような明瞭な結果を得ることができなかった。またすでに2023年度に予定していた神経細胞のcell lineやラットの神経細胞primary cellを用いて、in vitroにおける、RGMaと細胞骨格動態の実験系を確立しつつある。目下、RGMaの刺激が入りやすい細胞腫のスクリーニングを行っており、SHSYやNeuro2Aといった神経細胞のcell lineを使用し、RGMaで刺激を行い下流のシグナルを検討しているが、通常の条件では十分な刺激が入らないことが確認された。現在ラット神経細胞のprimary cellの樹立を行い、検討中である。

2022年度はRepulsive guidance molecule A(RGMa)抗体を投与したALSモデルマウスにおける、細胞骨格動態の検証を行った。ファロイジンとDNaseⅠによる免疫染色によりアクチン重合の程度の可視化を行ったところ、ALSモデルマウスにおいてアクチンの脱重合が誘導され、RGMa抗体投与によりそれが改善することが示された。またwestern boltをおこなうことで、RGMaシグナルの活性化の程度を定量化した。RGMaは細胞膜上のNeogeninと結合することで、Rhoを中心としたsmall GTPaseの経路を活性化することが知られている。今回、その下流であるSMADやProfilin、Cofilinの活性化を確認した所、ALSモデルマウスにおいてアクチン重合を阻害するCofilinが活性化しており、RGMa抗体投与によりそれが改善することが確認された。一方でもともと予想されていた、ALSモデルマウスにおけるtubulinの脱重合に関しては、CRMP2などの上流のシグナルをwestern blotで定量化したが、メカニズムを推定できるような明瞭な結果を得ることができなかった。またすでに2023年度に予定していた神経細胞のcell lineやラットの神経細胞primary cellを用いて、in vitroにおける、RGMaと細胞骨格動態の実験系を確立しつつある。目下、RGMaの刺激が入りやすい細胞腫のスクリーニングを行っており、SHSYやNeuro2Aといった神経細胞のcell lineを使用し、RGMaで刺激を行い下流のシグナルを検討しているが、通常の条件では十分な刺激が入らないことが確認された。現在ラット神経細胞のprimary cellの樹立を行い、検討中である。