Characterization of PLAGL1-FOXO1 fusion gene in alveolar rhabdomyosarcoma

令和4年度は、まず、PLAGL1-FOXO1融合遺伝子の全長をPCR増幅し、クローニングした。クローニングされたPLAGL1-FOXO1融合遺伝子の全長の配列が正しい配列であることをSangerシーケンスにて確認した。次にPLAGL1-FOXO1融合遺伝子をGFPベクターにサブクローニングし、293細胞株にトランスフェクションし、細胞内局在を確認した。蛍光顕微鏡で観察したところ、コントロールベクターを導入した細胞では、細胞全体に蛍光を認めたのに対して、PLAGL1-FOXO1融合遺伝子をサブクローニングしたGFPベクターを導入した細胞では蛍光が核内に局在していることが確認された。PLAGL1-FOXO1融合遺伝子は、PLAGL1遺伝子のDNA結合ドメインが保持されていることから、核内の局在が予想され、予想と合致した結果であった。FLAGベクターにもPLAGL1-FOXO1融合遺伝子をサブクローニングし、293細胞株に強制発現させたが、PLAGL1-FOXO1融合遺伝子の塩基長が長いためか、トランスフェクション効率が悪く、ウエスタンブロッティング法によるPLAGL1-FOXO1タンパクの同定には至らなかった。マウス筋芽細胞株であるC2C12細胞株やマウス線維芽細胞株である3T3細胞株のPLAGL1-FOXO1安定発現細胞株を作成するため、PLAGL1-FOXO1融合遺伝子をMSCVベクターにサブクローニングし、PLAGL1-FOXO1融合遺伝子の全長の配列が正しい配列であることをSangerシーケンスにて確認した。令和5年度以降、このベクターを用いて、C2C12細胞株や3T3細胞株のPLAGL1-FOXO1安定発現細胞株を作成し、PLAGL1-FOXO1融合遺伝子の機能解析を行う。

令和4年度は、まず、PLAGL1-FOXO1融合遺伝子の全長をPCR増幅し、クローニングした。クローニングされたPLAGL1-FOXO1融合遺伝子の全長の配列が正しい配列であることをSangerシーケンスにて確認した。次にPLAGL1-FOXO1融合遺伝子をGFPベクターにサブクローニングし、293細胞株にトランスフェクションし、細胞内局在を確認した。蛍光顕微鏡で観察したところ、コントロールベクターを導入した細胞では、細胞全体に蛍光を認めたのに対して、PLAGL1-FOXO1融合遺伝子をサブクローニングしたGFPベクターを導入した細胞では蛍光が核内に局在していることが確認された。PLAGL1-FOXO1融合遺伝子は、PLAGL1遺伝子のDNA結合ドメインが保持されていることから、核内の局在が予想され、予想と合致した結果であった。FLAGベクターにもPLAGL1-FOXO1融合遺伝子をサブクローニングし、293細胞株に強制発現させたが、PLAGL1-FOXO1融合遺伝子の塩基長が長いためか、トランスフェクション効率が悪く、ウエスタンブロッティング法によるPLAGL1-FOXO1タンパクの同定には至らなかった。マウス筋芽細胞株であるC2C12細胞株やマウス線維芽細胞株である3T3細胞株のPLAGL1-FOXO1安定発現細胞株を作成するため、PLAGL1-FOXO1融合遺伝子をMSCVベクターにサブクローニングし、PLAGL1-FOXO1融合遺伝子の全長の配列が正しい配列であることをSangerシーケンスにて確認した。令和5年度以降、このベクターを用いて、C2C12細胞株や3T3細胞株のPLAGL1-FOXO1安定発現細胞株を作成し、PLAGL1-FOXO1融合遺伝子の機能解析を行う。