GIST治療に向けた間葉系幹細胞を用いた腫瘍溶解性ウイルスの輸送システムの開発

本年度は、腫瘍溶解性ウイルス、reovirus のDrug delivery system（DDS)の 開発の基礎になる実験を遂行した。本研究では、間葉系幹細胞のexosomeをDDSとして使用するため、予備実験として間葉系幹細胞の培養液中に存在するexosomeの抽出および、間葉系幹細胞のreovirusの対する感受性を検証した。ヒト脂肪細胞由来の間葉系幹細胞を使用し、効率よくexosomeを回収するための培養条件の最適化、抽出の手順を確立した。さらに、間葉系幹細胞にreovirusを暴露し、WST-8アッセイによりreovirusによる増殖抑制能を評価した。Positive controlには、reovirusへの感受性が報告されているヒト大腸がん細胞株、HCT116を使用した。各細胞に、複数の濃度（1 multiplicity of infection (MOI), 3 MOI, 10 MOI)のreovirusを暴露し、24、４８、７２時間後に細胞の生存率を測定した。HCT116はreoviurusの濃度、暴露時間依存的に、細胞の生存率が低下したが、間葉系幹細胞ではreovirusによる増殖抑制は認めなかった。さらに、reovirusに暴露した間葉系幹細胞の培養液中のexosomeを抽出し、その有効性についてHCT116を用いてWST-8アッセイにより評価した。このexosomeは、濃度依存的にHCT116の増殖を抑制し、また、蛍光免疫染色では、このexosomeに暴露されたHCT116ではreoviruの蛋白の発現がみられ、間葉系幹細胞のexosomeがreovirusのDDSとして機能している可能性が示された。reovirusに暴露した間葉系幹細胞の培養液中のexosomeのサイズを流体計を用いて検証したところ、reovirusの粒子よりやや大きな100nmを主体としたものであった。さらに、電子顕微鏡を用いて、その形態を観察したところ、reovirusの粒子よりも、一回り大きな粒子を認められ、exosomeにreovirusが内包されている可能性が示された。

本年度は、腫瘍溶解性ウイルス、reovirus のDrug delivery system（DDS)の 開発の基礎になる実験を遂行した。本研究では、間葉系幹細胞のexosomeをDDSとして使用するため、予備実験として間葉系幹細胞の培養液中に存在するexosomeの抽出および、間葉系幹細胞のreovirusの対する感受性を検証した。ヒト脂肪細胞由来の間葉系幹細胞を使用し、効率よくexosomeを回収するための培養条件の最適化、抽出の手順を確立した。さらに、間葉系幹細胞にreovirusを暴露し、WST-8アッセイによりreovirusによる増殖抑制能を評価した。Positive controlには、reovirusへの感受性が報告されているヒト大腸がん細胞株、HCT116を使用した。各細胞に、複数の濃度（1 multiplicity of infection (MOI), 3 MOI, 10 MOI)のreovirusを暴露し、24、４８、７２時間後に細胞の生存率を測定した。HCT116はreoviurusの濃度、暴露時間依存的に、細胞の生存率が低下したが、間葉系幹細胞ではreovirusによる増殖抑制は認めなかった。さらに、reovirusに暴露した間葉系幹細胞の培養液中のexosomeを抽出し、その有効性についてHCT116を用いてWST-8アッセイにより評価した。このexosomeは、濃度依存的にHCT116の増殖を抑制し、また、蛍光免疫染色では、このexosomeに暴露されたHCT116ではreoviruの蛋白の発現がみられ、間葉系幹細胞のexosomeがreovirusのDDSとして機能している可能性が示された。reovirusに暴露した間葉系幹細胞の培養液中のexosomeのサイズを流体計を用いて検証したところ、reovirusの粒子よりやや大きな100nmを主体としたものであった。さらに、電子顕微鏡を用いて、その形態を観察したところ、reovirusの粒子よりも、一回り大きな粒子を認められ、exosomeにreovirusが内包されている可能性が示された。