GIST治療に向けた間葉系幹細胞を用いた腫瘍溶解性ウイルスの輸送システムの開発

开发利用间充质干细胞治疗胃肠道间质瘤的溶瘤病毒递送系统

基本信息

批准号：
22K07965
负责人：
森義徳
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07965/
关键词：
reovirus exosome DDS GIST 腫瘍溶解性ウイルス Drug delivery system

项目摘要

本年度は、腫瘍溶解性ウイルス、reovirus のDrug delivery system（DDS)の開発の基礎になる実験を遂行した。本研究では、間葉系幹細胞のexosomeをDDSとして使用するため、予備実験として間葉系幹細胞の培養液中に存在するexosomeの抽出および、間葉系幹細胞のreovirusの対する感受性を検証した。ヒト脂肪細胞由来の間葉系幹細胞を使用し、効率よくexosomeを回収するための培養条件の最適化、抽出の手順を確立した。さらに、間葉系幹細胞にreovirusを暴露し、WST-8アッセイによりreovirusによる増殖抑制能を評価した。Positive controlには、reovirusへの感受性が報告されているヒト大腸がん細胞株、HCT116を使用した。各細胞に、複数の濃度（1 multiplicity of infection (MOI), 3 MOI, 10 MOI)のreovirusを暴露し、24、４８、７２時間後に細胞の生存率を測定した。HCT116はreoviurusの濃度、暴露時間依存的に、細胞の生存率が低下したが、間葉系幹細胞ではreovirusによる増殖抑制は認めなかった。さらに、reovirusに暴露した間葉系幹細胞の培養液中のexosomeを抽出し、その有効性についてHCT116を用いてWST-8アッセイにより評価した。このexosomeは、濃度依存的にHCT116の増殖を抑制し、また、蛍光免疫染色では、このexosomeに暴露されたHCT116ではreoviruの蛋白の発現がみられ、間葉系幹細胞のexosomeがreovirusのDDSとして機能している可能性が示された。reovirusに暴露した間葉系幹細胞の培養液中のexosomeのサイズを流体計を用いて検証したところ、reovirusの粒子よりやや大きな100nmを主体としたものであった。さらに、電子顕微鏡を用いて、その形態を観察したところ、reovirusの粒子よりも、一回り大きな粒子を認められ、exosomeにreovirusが内包されている可能性が示された。

今年，我们进行了实验，该实验将作为开发溶瘤病毒，疾病病毒，药物输送系统（DDS）的基础。在这项研究中，将来自间充质干细胞的外泌体用作DDS，作为初步实验，我们检查了在间充质干细胞培养基中存在的外泌体的提取以及间充质干细胞中葡萄病毒的敏感性。使用源自人脂肪细胞的间充质干细胞，我们建立了一种方法，以优化培养条件和提取有效收集外泌体的方法。此外，依默病毒暴露于间充质干细胞中，通过WST-8测定法评估了葡萄病毒抑制生长的能力。对于阳性对照，使用了HCT116，这是一种据报道易受息护病毒的人类结肠癌细胞系。每个细胞暴露于多个浓度（1多个感染（MOI），3个MOI，10 MOI）的静脉病毒，并在24、48和72小时后确定细胞活力。 HCT116取决于肠疾病病毒和暴露时间的浓度降低了细胞的存活率，但没有依泊病毒抑制间充质干细胞的生长。此外，提取了暴露于肠疾病毒病毒的间充质干细胞培养物中的外泌体，并使用HCT116通过WST-8测定法评估其功效。该外泌体以浓度依赖性抑制了HCT116的生长，荧光免疫染色表明，在暴露于该外部体的HCT116中观察到垂体蛋白的表达，表明外泌体间充质干细胞可能起到Reovirus的DDS的作用。当我们验证使用流体表暴露于葡萄病毒的间充质干细胞培养基中外泌体的大小时，发现大小为100 nm，略大，略大于e虫的粒子。此外，当使用电子显微镜观察形态时，发现颗粒比依泊病毒大的粒子大于葡萄病毒颗粒，这表明可能包含在外泌体中。