GIST治療に向けた間葉系幹細胞を用いた腫瘍溶解性ウイルスの輸送システムの開発

开发利用间充质干细胞治疗胃肠道间质瘤的溶瘤病毒递送系统

• 批准号: 22K07965
• 负责人: 森 義徳
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07965/
• 关键词: reovirus; exosome; DDS; GIST; 腫瘍溶解性ウイルス; Drug delivery system

本年度は、腫瘍溶解性ウイルス、reovirus のDrug delivery system（DDS)の 開発の基礎になる実験を遂行した。本研究では、間葉系幹細胞のexosomeをDDSとして使用するため、予備実験として間葉系幹細胞の培養液中に存在するexosomeの抽出および、間葉系幹細胞のreovirusの対する感受性を検証した。ヒト脂肪細胞由来の間葉系幹細胞を使用し、効率よくexosomeを回収するための培養条件の最適化、抽出の手順を確立した。さらに、間葉系幹細胞にreovirusを暴露し、WST-8アッセイによりreovirusによる増殖抑制能を評価した。Positive controlには、reovirusへの感受性が報告されているヒト大腸がん細胞株、HCT116を使用した。各細胞に、複数の濃度（1 multiplicity of infection (MOI), 3 MOI, 10 MOI)のreovirusを暴露し、24、４８、７２時間後に細胞の生存率を測定した。HCT116はreoviurusの濃度、暴露時間依存的に、細胞の生存率が低下したが、間葉系幹細胞ではreovirusによる増殖抑制は認めなかった。さらに、reovirusに暴露した間葉系幹細胞の培養液中のexosomeを抽出し、その有効性についてHCT116を用いてWST-8アッセイにより評価した。このexosomeは、濃度依存的にHCT116の増殖を抑制し、また、蛍光免疫染色では、このexosomeに暴露されたHCT116ではreoviruの蛋白の発現がみられ、間葉系幹細胞のexosomeがreovirusのDDSとして機能している可能性が示された。reovirusに暴露した間葉系幹細胞の培養液中のexosomeのサイズを流体計を用いて検証したところ、reovirusの粒子よりやや大きな100nmを主体としたものであった。さらに、電子顕微鏡を用いて、その形態を観察したところ、reovirusの粒子よりも、一回り大きな粒子を認められ、exosomeにreovirusが内包されている可能性が示された。

This year, the foundation for the development of a Drug delivery system (DDS) for tumor solubility and reovirus has been completed. In this study, we examined the use of exosome DDS in mesenchymal stem cells and the susceptibility of mesenchymal stem cells to exosome extraction and reovirus in culture medium. To optimize the culture conditions and establish the extraction procedure of mesenchymal stem cells derived from adipocytes WST-8 is a new type of stem cell. Positive control was reported for the sensitivity of reovirus to large intestine cell lines and HCT116. Cell survival was measured at multiple concentrations (1 multiplicity of infection (MOI), 3 MOI, 10 MOI) and at exposure times of 24, 48, and 72 hours. HCT116 reoviurus concentration, exposure time dependent, cell survival rate decreased, mesenchymal stem cells reovirus proliferation inhibition Exosomes were extracted from mesenchymal stem cell cultures exposed to reovirus and evaluated for their efficacy in HCT116 using WST-8. The proliferation of HCT116 was inhibited in a concentration-dependent manner by immunostaining, and the expression of reoviru protein in HCT116 exposed to the exosome was shown to be possible for reovirus and DDS function in mesenchymal stem cells. The exosome in the culture medium of reovirus exposed mesenchymal stem cells was detected by a flow meter. The exosome in the culture medium of reovirus was detected by a flow meter. In addition, the electron microscope is used to detect the particle size, particle size, and exovirus size.