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Analysis of plasma kallikrein-dependent TGF-beta activation and liver fibrosis using the knock-in-mice

使用敲入小鼠分析血浆激肽释放酶依赖性 TGF-β 激活和肝纤维化

基本信息

批准号：
22K08067
负责人：
古谷裕
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08067/
关键词：
肝線維化肝がん TGF-β ノックインマウス血漿カリクレイン

项目摘要

TGF-βの活性化は肝線維化や肝がんの進行に関与しており、この活性化機構を解明することが重要である。我々は初期の肝線維化においてセリンプロテアーゼである血漿カリクレイン(PLK)によるTGF-β前駆体であるLAPの切断がTGF-β1の活性化を誘導することを見出している。しかしながらPLK依存的なTGF-β1活性化がどの様に肝線維化に関与しているのか明らかとなっていない。そこで当課題ではPLKによるLAP切断部位Arg58, Leu59に変異を導入し切断できない配列を持つノックインマウスをライン化し、肝線維化モデルを作製し、ノックインマウスと野生型マウスを比較することによりPLK依存的なTGF-β1活性化の役割を明らかにすることを目的として研究を行った。CRISPR/Cas9システムを用いて、TGF-β1 LAPの血漿カリクレイン切断サイトであるArg58, Leu59から、切断できないAla58, Ala59をコードする遺伝子配列に組換えたノックインマウスを作製し、変異の生殖系列への移行を確認した。このマウスのライン化を実施した。このTGF-β1ノックインマウスと野生型マウスを用いて胆管結紮による肝線維化モデルを作製し、胆管結紮（BDL）3日後と13日後に血漿中のALTとAST量とLAP-D量を測定した。肝切片を作製し、シリウスレッド染色を行い肝線維化領域を染色した。野生型マウスの血漿中ではBDL後13日目でLAP-Dの上昇が見られたが、ノックインマウスの血漿中で検出できなかった。また、血漿中のALT, ASTが野生型マウスと比較してノックインマウスではBDL後13日目で有意に抑制されたが、３日目では抑制されなかった。肝切片をシリウスレッド染色した結果、BDL後13日目で野生型マウスと比較してノックインマウスでは肝線維化が抑制される傾向があった。

Activation of TGF-β is important for understanding the mechanism of liver maintenance and activation. In the early stages of liver maintenance, we found that the activation of TGF-β1 was induced by plasma kinase (PLK), which was the precursor of TGF-β. The activation of TGF-β1, which is dependent on PLK, is related to liver maintenance. This research is aimed at controlling PLK-dependent TGF-β1 activation by comparing PLK-dependent LAP cleavage sites Arg58 and Leu59 with wild-type ones. When CRISPR/Cas9 is used, the plasma kalikening of TGF-β1 LAP can be cut off at Arg58, Leu59, and the kalikening of Ala58, Ala59 can be cut off at the same time. The gene arrangement is changed and the migration of the different reproductive series is confirmed. It's not like we're going to do this. The levels of ALT, AST and LAP-D in plasma were measured after 3 days and 13 days of bile duct ligation (BDL). Liver sections were prepared and stained. 13 days after BDL, LAP-D increased in the plasma of wild-type mice. ALT and AST in plasma were intentionally inhibited 13 days after BDL compared to wild-type BDL, and were inhibited 3 days after BDL. Liver sections were stained for BDL and compared with wild-type liver sections at 13 days.