In vitro変異体スクリーニングによる遺伝的要因の検討法の確立

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2022年度は、解析系構築のための分子生物学実験を行い、網羅的in vitro変異体スクリーニング解析の基礎的なプロトコールおよび解析プログラムの確立ができた。一塩基変異の網羅的導入の実験条件の検討および確定を行い、変異体ベクターライブラリーを作成し、パイロットスタディとして、ライブラリーにより変異体を導入した培養細胞アッセイ系からサンプル採取を行い解析した。また、次世代シークエンスを用いた変異率検討の実験条件検討、同サンプルでのパイロット解析、複数サンプルでの再現性検討、配列データ解析手法の構築・改良を行った。一塩基変異体ベクターライブラリー作成、変異率解析、再現性、配列データ解析の各ステップともに良好な結果であり、本手法による変異体機能評価が可能と考えられた。本手法を用いることで、対象遺伝子の多種の変異体を導入した各種細胞アッセイ系での変異体率の変化の検討が可能であり、各変異の機能異常の程度についてin vitroでの評価をハイスループットに行うことが可能となり、対象遺伝子における一塩基変異の機能的影響を体系的網羅的に検討することが可能と考えられ、現状においてその基本的な解析が可能となった。今後、確定データのための細胞アッセイおよびデータ解析を行い、つづいて本手法で同定される病的変異の機能異常の個別的検証確認へと進める。また、プロトコールおよび解析プログラムについて改良をさらに進める。