急性骨髄性白血病をターゲットとした二重標的キメラ抗原受容体T細胞の開発

开发针对急性髓系白血病的双靶点嵌合抗原受体T细胞

• 批准号: 22K08449
• 负责人: 花井 藍子
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Shinshu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08449/
• 关键词: キメラ抗原受容体; 急性骨髄性白血病

抗原消失による再発に対する解決策として二重標的CAR-T細胞の戦略が必要とされる。これまで当研究グループで開発されたCD116を標的とするGMR CAR-T細胞に加えて、もう一つの抗原認識部位を搭載したCAR-T細胞の開発を目指す。コンピューターシミュレーションによりCD123のリガンドであるIL-3変異体の分子設計を実施した。IL-3とIL-3受容体α鎖との複合体の立体構造をもとにIL-3野生型よりIL-3受容体α鎖結合の弱い変異体、同程度の変異体、強い変異体の候補を予測した。まずIL-3内のすべてのアミノ酸を1点変異させ、簡易的なエネルギーを計算し、点変異候補を見出した。さらに点変異候補から複数変異候補を選び、より精度の高いエネルギー計算を実施して、候補品を提案した。選定されたIL-3候補配列をCARプラスミドに組み込み、CD123 CARプラスミドを作製した。作製したプラスミドを用いて、健常人ドナーから採取、分離したヒト末梢血単核球(PBMCs)にエレクトロポレーションにより遺伝子導入、培養を実施して、CD123 CAR-T細胞を作製しフローサイトメトリー解析によりCD3陽性率とCAR陽性率を測定した。CD123 CAR-T細胞の抗腫瘍活性を測定するためにAML腫瘍株との共培養試験を実施した。培養3～5日後に共培養した細胞を回収しフローサイトメトリーにより腫瘍細胞数を解析したところ、培養したCD123 CAR-T細胞は優れた抗腫瘍活性を有することが明らかとなった。本研究によりAMLに対する二重標的CD123-GMR-CAR-T細胞作製のための抗原認識部位の選定に成功した。

A strategy for the re-emergence of antigens is needed to address the issue of double-labeled CAR-T cells. This study is aimed at developing GMR CAR-T cells that target CD116 and are capable of recognizing antigen sites. The molecular design of CD123 was implemented. The stereostructure of IL-3 receptor α-lock complex was predicted by the candidate of IL-3 wild-type receptor α-lock binding with weak, equal, and strong variants. 1 point difference, simple calculation, point difference candidate in IL-3 The number of different candidates is selected, the accuracy of the calculation is high, and the candidate is proposed. Select IL-3 candidate configuration for CAR selection, CD123 CAR selection. CD123 CAR-T cell production, analysis, CD3 positive rate and CAR positive rate were determined by using CD123 CAR-T cells in vitro, isolating PBMCs from healthy individuals, introducing and culturing CD123 CAR-T cells. CD123 CAR-T cell anti-tumor activity was determined and AML tumor strains were co-cultured. After 3~5 days of culture, the number of tumor cells was analyzed and the anti-tumor activity of CD123 CAR-T cells was determined. In this study, we successfully identified the antigen recognition sites for AML targeting CD123-GMR-CAR T cell production.