DNAメチル化を基軸とした炎症ストレスとクローン性造血の相互的役割の解明

JAK2変異やDNMT3Aの変異が同時に起こると強い炎症、造血幹細胞の再構築を促進させ、それにより血栓症の増加や骨髄増殖性腫瘍の進行による骨髄線維症の発症に関わる可能性が考慮される。このことが、クローン性造血と炎症性ストレスが血管リモデリング、腫瘍進展にどのように関与しているのか、その詳細についてDNMT3AとJAK2変異の視点から明らかにするために、2022年度は、培養細胞を用いたin vitroの系の作製に加えて、in vivoの系として遺伝子改変マウスの作製に着手した。in vitroの系では、好中球株HL-60に、JAK2V617F遺伝子が入ったプラスミドをトランスフェクションし、恒常的に発現する細胞の作製を試みている。いくつかのトランスフェクション試薬を用い実験を行った結果、JAK2V617F遺伝子の発現は一過性には確認されている。今後、JAK2V617F変異とDNMT3A欠失を同時に起こさせ、その影響を研究するためには、JAK2V617F遺伝子が安定的に発現する細胞を作る必要があるため、JAK2V617F遺伝子が安定的に発現する細胞の作製を進めている。また、好中球株HL-60にDNMT3AのsiRNAをトランスフェクトし、DNMT3Aのノックダウンを試みた。いくかの試薬を使って実験を行ったが、タンパク質発現、RNA発現ともに有意なノックダウンが起こらなかった。今後、他の方法によるDNMT3Aノックダウンを検討するとともに、DNMT3AR882H変異遺伝子の細胞への導入も検討している。in vivoの系では、DNMT3AR882H変異とJAK2V617F変異を反映するマウスの作製を進めた。Ert-Cre-homoマウスとJAK2V617F/WT；Dnmt3aR878H/WTマウスを交配し、JAK2V617F/WT；Dnmt3aR878H/WTマウスがほぼ完成した。次年度は、変異を導入したHL-60とJAK2V617F/WT；Dnmt3aR878H/WTマウスと用いてNETs形成と炎症性サイトカイン、凝固マーカーの関連性などを検討する予定である。

JAK2変異やDNMT3Aの変異が同時に起こると強い炎症、造血幹細胞の再構築を促進させ、それにより血栓症の増加や骨髄増殖性腫瘍の進行による骨髄線維症の発症に関わる可能性が考慮される。このことが、クローン性造血と炎症性ストレスが血管リモデリング、腫瘍進展にどのように関与しているのか、その詳細についてDNMT3AとJAK2変異の視点から明らかにするために、2022年度は、培養細胞を用いたin vitroの系の作製に加えて、in vivoの系として遺伝子改変マウスの作製に着手した。in vitroの系では、好中球株HL-60に、JAK2V617F遺伝子が入ったプラスミドをトランスフェクションし、恒常的に発現する細胞の作製を試みている。いくつかのトランスフェクション試薬を用い実験を行った結果、JAK2V617F遺伝子の発現は一過性には確認されている。今後、JAK2V617F変異とDNMT3A欠失を同時に起こさせ、その影響を研究するためには、JAK2V617F遺伝子が安定的に発現する細胞を作る必要があるため、JAK2V617F遺伝子が安定的に発現する細胞の作製を進めている。また、好中球株HL-60にDNMT3AのsiRNAをトランスフェクトし、DNMT3Aのノックダウンを試みた。いくかの試薬を使って実験を行ったが、タンパク質発現、RNA発現ともに有意なノックダウンが起こらなかった。今後、他の方法によるDNMT3Aノックダウンを検討するとともに、DNMT3AR882H変異遺伝子の細胞への導入も検討している。in vivoの系では、DNMT3AR882H変異とJAK2V617F変異を反映するマウスの作製を進めた。Ert-Cre-homoマウスとJAK2V617F/WT；Dnmt3aR878H/WTマウスを交配し、JAK2V617F/WT；Dnmt3aR878H/WTマウスがほぼ完成した。次年度は、変異を導入したHL-60とJAK2V617F/WT；Dnmt3aR878H/WTマウスと用いてNETs形成と炎症性サイトカイン、凝固マーカーの関連性などを検討する予定である。