血小板リガンドとSiglecの相互作用による好中球・単球の血栓形成促進機構の解明

血中において高分子量のマルチマーとして存在するvon Willebrand factor (VWF)は血管損傷部位に露出したコラーゲンと血小板の双方に結合し血小板血栓形成を促進する一方、メタロプロテアーゼのADAMTS13はVWFを特異的に切断することで過剰な血栓形成を抑制している。我々は白血球の細胞膜上のシアル酸を認識する免疫受容体として同定されたSiglec-5およびSiglec-14が、VWFのみならずADAMTS13を認識しエンドサイトーシスすることを明らかにし、当該年度において論文として報告した。Siglec-5/14は好中球と単球に高発現しているが、活性化した血小板はこれら２種の白血球に結合することが知られている。我々は好中球・単球と血小板の結合時に、血小板上のSiglec-5/14リガンドが好中球のSiglec-5/14に結合することで、好中球の免疫機能に影響するのではないかと考え、リガンドの同定を目指した実験を当該年度から開始した。初めに、Siglec-14を発現させたTHP-1細胞のリガンドスクリーニングで同定されたシスリガンドをはじめとした様々な手法で同定された複数のSiglecリガンドの既存データを解析し、血小板膜上で発現しているtoll-like receptor 2 (TLR2)をリガンド候補として選択した。初めにHEK293細胞にTLR2を発現ベクターのトランスフェクションによって発現させて、Fc融合可溶性Siglec-5およびSiglec-14タンパク質への結合を免疫染色によって調べたが、結合を観察することはできなかった。そこで現在さらに探索範囲を広げて、TLR4およびPSGL-1などのリガンドへの結合を同じ手法で調べたが結合は確認できていない。

血中において高分子量のマルチマーとして存在するvon Willebrand factor (VWF)は血管損傷部位に露出したコラーゲンと血小板の双方に結合し血小板血栓形成を促進する一方、メタロプロテアーゼのADAMTS13はVWFを特異的に切断することで過剰な血栓形成を抑制している。我々は白血球の細胞膜上のシアル酸を認識する免疫受容体として同定されたSiglec-5およびSiglec-14が、VWFのみならずADAMTS13を認識しエンドサイトーシスすることを明らかにし、当該年度において論文として報告した。Siglec-5/14は好中球と単球に高発現しているが、活性化した血小板はこれら２種の白血球に結合することが知られている。我々は好中球・単球と血小板の結合時に、血小板上のSiglec-5/14リガンドが好中球のSiglec-5/14に結合することで、好中球の免疫機能に影響するのではないかと考え、リガンドの同定を目指した実験を当該年度から開始した。初めに、Siglec-14を発現させたTHP-1細胞のリガンドスクリーニングで同定されたシスリガンドをはじめとした様々な手法で同定された複数のSiglecリガンドの既存データを解析し、血小板膜上で発現しているtoll-like receptor 2 (TLR2)をリガンド候補として選択した。初めにHEK293細胞にTLR2を発現ベクターのトランスフェクションによって発現させて、Fc融合可溶性Siglec-5およびSiglec-14タンパク質への結合を免疫染色によって調べたが、結合を観察することはできなかった。そこで現在さらに探索範囲を広げて、TLR4およびPSGL-1などのリガンドへの結合を同じ手法で調べたが結合は確認できていない。