TTC7A欠損に起因する難治性腸閉鎖症のパラログ遺伝子発現促進による治療

通过促进旁系同源基因表达治疗 TTC7A 缺陷引起的难治性肠闭锁

• 批准号: 22K08725
• 负责人: 金井 理紗
• 金额: $ 2.33万
• 依托单位: Japanese Red Cross Wakayama Medical Center
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08725/
• 关键词: 炎症性腸疾患; 腸閉鎖; 小児; TTC7A; TTC7B; SW620; LoVo; リン脂質

1.ヒト細胞を用いたTTC7A/TTC7Bダブルノックアウトa. HeLa 細胞：TTC7AとTTC7Bのダブルノックアウト株が生存可能かを検討するため、野生型HeLa細胞とTTC7A欠損HeLa細胞に対して、CRISPR/Cas9によるTTC7Bの遺伝子破壊を行なった。HeLa細胞はTTC7Bのアレルを3本持つが、実験の結果、野生型HeLa細胞は3アレルとも変異が起きた細胞を採取できた（TTC7Bのノックアウトは可能であった）が、TTC7A欠損HeLa細胞は1または2アレルの変異細胞は得られたものの、3アレルとも変異した細胞は採取できなかった。よって研究計画当初の予想通り、HeLa細胞ではTTC7AとTTC7Bのダブルノックアウトは不可能で、どちらかが生存に必須である可能性（合成致死の可能性）が高まった。b.ヒト腸管上皮細胞株：HeLa細胞では生存必須性が示唆されたため、腸管上皮細胞株においてもそれが成立するかを検証することとした。ヒト腸管上皮細胞株（LoVo, SW620）に対してCRISPR/Cas9によるTTC7Aの遺伝子破壊を行い、TTC7A欠損細胞株の作成を試みた。LoVo, SW620ともにTTC7Aのアレルを2本持つが、実験の結果、LoVoはSW620と比較して細胞増殖が遅い傾向にあり、LoVoでは片アレルのノックアウトは可能であったものの両アレルのノックアウトは不可能であり、TTC7Aのノックアウト不可能と判断した。SW620においては両アレルのノックアウトが可能であり、TTC7A欠損SW620細胞株が2つ作成できた。

1. Youdaoplaceholder0 cells を using ヒト たTTC7A/TTC7Bダブ ノッ ノッ アウトa. HeLa cells: TTC7A と TTC7B の ダ ブ ル ノ ッ ク ア ウ ト が strains survival may か を beg す 検 る た め, wild type HeLa と TTC7A owe loss HeLa に し seaborne て, CRISPR/Cas9 に よ る TTC7B の heritage 伝 son broken 壊 を line な っ た. HeLa は TTC7B の ア レ ル を 3 this hold つ が, be 験 の results, wild type HeLa は 3 ア レ ル と も - different が up き を た cells take で き た (TTC7B の ノ ッ ク ア ウ ト は may で あ っ た) が, TTC7A owe damage HeLa は 1 ま た は 2 ア レ ル の は - different cells have ら れ た も の の, 3 ア The レ と と と た variant of the た cells is taken by で な な った った った った. よ っ て research project at the beginning の to think り, HeLa で は TTC7A と TTC7B の ダ ブ ル ノ ッ ク ア ウ ト は impossible で, ど ち ら か が survival に must で あ likely possibility (synthetic lethal の) が る ま っ た. B. ヒ ト insufflate epithelial cell lines: HeLa で は survival necessity が in stopping さ れ た た め, insufflate epithelial cell lines に お い て も そ れ が established す る か を 検 card す る こ と と し た. The ヒト intestinal epithelial cell line (LoVo, SW620) に was used to prepare a を test みた against the <s:1> てCRISPR/Cas9によるTTC7A heritage 伝 seed break 壊を line 壊を and TTC7A underdamaged cell line <e:1>. LoVo, SW620 と も に TTC7A の ア レ ル を 2 hold つ が, be 験 の results, LoVo は SW620 と compare し て cells raised colonization が 遅 い tendency に あ り, LoVo で は piece ア レ ル の ノ ッ ク ア ウ ト は may で あ っ た も の の struck ア レ ル の ノ ッ ク ア ウ ト は impossible で あ り, TTC7A の ノ ッ ク ア ウ ト と impossible Judge た. SW620 に お い て は struck ア レ ル の ノ ッ ク ア ウ ト が may で あ り, 2 つ TTC7A owe loss SW620 cell lines が made で き た.