TTC7A欠損に起因する難治性腸閉鎖症のパラログ遺伝子発現促進による治療

1.ヒト細胞を用いたTTC7A/TTC7Bダブルノックアウトa. HeLa 細胞：TTC7AとTTC7Bのダブルノックアウト株が生存可能かを検討するため、野生型HeLa細胞とTTC7A欠損HeLa細胞に対して、CRISPR/Cas9によるTTC7Bの遺伝子破壊を行なった。HeLa細胞はTTC7Bのアレルを3本持つが、実験の結果、野生型HeLa細胞は3アレルとも変異が起きた細胞を採取できた（TTC7Bのノックアウトは可能であった）が、TTC7A欠損HeLa細胞は1または2アレルの変異細胞は得られたものの、3アレルとも変異した細胞は採取できなかった。よって研究計画当初の予想通り、HeLa細胞ではTTC7AとTTC7Bのダブルノックアウトは不可能で、どちらかが生存に必須である可能性（合成致死の可能性）が高まった。b.ヒト腸管上皮細胞株：HeLa細胞では生存必須性が示唆されたため、腸管上皮細胞株においてもそれが成立するかを検証することとした。ヒト腸管上皮細胞株（LoVo, SW620）に対してCRISPR/Cas9によるTTC7Aの遺伝子破壊を行い、TTC7A欠損細胞株の作成を試みた。LoVo, SW620ともにTTC7Aのアレルを2本持つが、実験の結果、LoVoはSW620と比較して細胞増殖が遅い傾向にあり、LoVoでは片アレルのノックアウトは可能であったものの両アレルのノックアウトは不可能であり、TTC7Aのノックアウト不可能と判断した。SW620においては両アレルのノックアウトが可能であり、TTC7A欠損SW620細胞株が2つ作成できた。

1.ヒト細胞を用いたTTC7A/TTC7Bダブルノックアウトa. HeLa 細胞：TTC7AとTTC7Bのダブルノックアウト株が生存可能かを検討するため、野生型HeLa細胞とTTC7A欠損HeLa細胞に対して、CRISPR/Cas9によるTTC7Bの遺伝子破壊を行なった。HeLa細胞はTTC7Bのアレルを3本持つが、実験の結果、野生型HeLa細胞は3アレルとも変異が起きた細胞を採取できた（TTC7Bのノックアウトは可能であった）が、TTC7A欠損HeLa細胞は1または2アレルの変異細胞は得られたものの、3アレルとも変異した細胞は採取できなかった。よって研究計画当初の予想通り、HeLa細胞ではTTC7AとTTC7Bのダブルノックアウトは不可能で、どちらかが生存に必須である可能性（合成致死の可能性）が高まった。b.ヒト腸管上皮細胞株：HeLa細胞では生存必須性が示唆されたため、腸管上皮細胞株においてもそれが成立するかを検証することとした。ヒト腸管上皮細胞株（LoVo, SW620）に対してCRISPR/Cas9によるTTC7Aの遺伝子破壊を行い、TTC7A欠損細胞株の作成を試みた。LoVo, SW620ともにTTC7Aのアレルを2本持つが、実験の結果、LoVoはSW620と比較して細胞増殖が遅い傾向にあり、LoVoでは片アレルのノックアウトは可能であったものの両アレルのノックアウトは不可能であり、TTC7Aのノックアウト不可能と判断した。SW620においては両アレルのノックアウトが可能であり、TTC7A欠損SW620細胞株が2つ作成できた。