FFPE標本に対する超高感度微量解析のための革新的cDNA合成法の開発

开发用于 FFPE 样本超灵敏微量分析的创新 cDNA 合成方法

• 批准号: 22K08898
• 负责人: 宮尾 晋太朗
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Nara Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08898/
• 关键词: FFPE; RNA-seq; single cell RNA sequence

マウスES培養細胞をホルマリン固定した細胞に対する定量性の高いcDNA合成法の確立予備実験と同様に「2i+LIF」条件下で培養した, より均一性の高いES細胞集団を標準試料として使用し, 仮説として挙げた方法論の条件検討を行う. 単離したES細胞をホルマリン液に浮遊させて固定を行い, 遠心し洗浄する. 実体顕微鏡で観察下に1-10細胞程の微少量を採取し, cDNA合成を行う. また同一の細胞集団から未固定の細胞も採取し, cDNA合成を行う. 代表的な遺伝子群の発現レベルをqPCRで比較し, ホルマリン固定された細胞において生細胞に近いレベルでの合成効率を目標とする. この行程においてはSC3-seq法に加える試薬の影響や, 温度条件によって生じる可能性のあるRNA分解に留意しつつ, cDNA合成を最適化する.予備実験段階では24時間ホルマリン固定を行った細胞に対しては, タンパク分解酵素を加えることでcDNA合成効率は改善は認めたが, さらに精度の向上を目指し, 条件検討を追加で行う. その他より効率的に細胞溶解するために, detergentの検討やその他試薬の条件検討を行い, ES細胞のホルマリン固定という最も安定的な条件における, 手法のbrushupを行った.その結果, 現在使用していたSC3-seq法ではない手法に対してタンパク分解酵素の行程を加えるとどうなるかを検証した.

Establishment of a quantitative cDNA synthesis method for ES cell culture under the same conditions as "2i +LIF" The isolated ES cells are suspended and fixed in a liquid medium, allowing them to be washed remotely. In vivo microscopical observation showed that a small amount of DNA was extracted from 1-10 cells, and cDNA synthesis was carried out. The same set of cells is not fixed. cDNA synthesis is performed. qPCR was used to compare the expression of protein in the target gene subgroup, and the synthesis efficiency of protein in the target gene subgroup was compared with that in the target gene subgroup. The SC3-seq method is used to optimize the synthesis of cDNA. To prepare for the next stage, 24 hours, the cell line is fixed, and the cDNA synthesis efficiency is improved. The conditions for cell lysis, detergent detection, and other agents are discussed. The conditions for cell immobilization, and manual brushup are discussed. As a result, the SC3-seq method is now used to verify the processing of the enzyme.