オルガノイドを用いたメチル基転移酵素による肝内胆管癌リンパ節転移の機序解明

利用类器官阐明甲基转移酶引起的肝内胆管癌淋巴结转移的机制

• 批准号: 22K08900
• 负责人: 速水 晋也
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Wakayama Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08900/
• 关键词: 肝内胆管癌; SMYD2; メチル化; オルガノイド; CRISPR/Cas9; メチル基転移酵素

i) 胆管癌オルガノイドの樹立がんオルガノイド「F-PDO」の胆管癌由来RBIL001-2 (F_PDO_000012) を用いて、F-PDOプロトコールに則り、専用の培養液Cancer Cell Expansion Media plus（032-25745, 富士フイルム和光純薬）にて継代、3D立体構造を確認した。ii) オルガノイドSMYD2発現解析－免疫化学染色樹立培養したRBIL001-2におけるSMYD2発現解析として免疫化学染色を行った。抗SMYD2抗体（mouse monoclonal, sc-393827; Santa Cruz Biotechnology）および二次抗体Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594; ab150116, abcam)を使用、当大学に設置されている 共焦点レーザー走査型顕微鏡（ZEISS Confocal Laser Scanning Microscope Model LSM780）にて観察した。iii) SMYD2抑制系実験システムの構築：CRISPR/Cas9によるSMYD2抑制系の構築オルガノイドにおけるSMYD2抑制系として、CRISPR/Cas9遺伝子改変技術を使用した。Manufacturers’ protocolに則り、Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific)によるリポフェクタミン法でSMYD2 CRISPRプラスミド(h)（sc-403129; Santa Cruz Biotechnology）を導入した。免疫化学染色にてSMYD2の蛍光低下ないし消失を確認した。

i) The origin of cholangiocarcinoma is RBIL001 -2 (F_PDO_00012), and the culture medium for F-PDO is Cancer Cell Expansion Media plus (032-25745, Fuji and Light Purity). ii) SMYD2 detection analysis-immunochemical staining culture establishment RBIL001 -2 detection analysis-immunochemical staining Anti-SMYD2 antibody (mouse monoclonal, sc-393827; Santa Cruz Biotechnology) and secondary antibody Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594; ab150116, abcam) were used and examined by ZEISS Confocal Laser Scanning Microscope Model LSM780 in university settings. iii) Construction of SMYD2 Inhibitor System: Construction of SMYD2 Inhibitor System for CRISPR/Cas9 and Use of CRISPR/Cas9 Gene Modification Technology. SMYD2 CRISPR protocol (h)(sc-403129; Santa Cruz Biotechnology) was introduced by Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific). Immunochemical staining confirmed the disappearance of SMYD2 in the absence of light.