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髄液中cell-free DNAへの増幅技術による革新的グリオーマ関連遺伝子解析

利用脑脊液中游离 DNA 扩增技术进行创新性神经胶质瘤相关基因分析

基本信息

批准号：
22K09216
负责人：
安達淳一
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Saitama Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K09216/
关键词：
glioma CSF ccfDNA liquid biopsy biopsy

项目摘要

2021年に新たに改訂された脳腫瘍病理分類にて、グリオーマの分子遺伝子学的解析は、診断や病態の把握に関してさらに重要度が高まった。グリオーマは再発、悪性化しやすく、その都度、腫瘍組織を採取して遺伝子解析を行うには侵襲が大きい。そこで、組織採取の代用として脳脊髄液中の腫瘍由来の circulating cell free DNA(ccfDNA) を解析する技術が発展しているが、脳脊髄液由来の ccfDNA は極めて微量であり、遺伝子解析可能な例は限定されているのが現状である。我々は、グリオーマ患者の脳脊髄液中の ccfDNA を in vitro で増幅し、高感度なassay によりグリオーマ関連遺伝子の統合的解析を効率的に行う方法を確立することを試みた。今回、5例のグリオーマ症例の腰椎穿刺で得られた髄液1mlから、Maxwell RSC instrument を用いて腫瘍由来ccfDNAを抽出、精細した。IDH1, H3F3A各遺伝子の変異のホットスポット部位を high resolution melting (HRM) 法で、TERT遺伝子変異については droplet digital PCR 法で、MGMTプロモーターのメチル化についてはメチル化特異的HRM法にて解析した。ccfDNAが微量であり、解析不能であったサンプルに対しては、GenomiPhi kit を用いてDNAを約500倍量に増幅し、同様のassay法で解析した。 5例中2例は GenomiPhi kitによる増幅を要したが、全例で上記のグリオーマ関連遺伝子解析を実施し得た。低悪性度グリオーマや脳室やくも膜下腔に接していないグリオーマでは得られる ccfDNAが微量であるが、本増幅方法を用いることで髄液を用いた Liquid biopsy の可能性を高められると考えられた。

In 2021, the importance of molecular genetics analysis, diagnosis and disease assurance in the classification of tumor pathology was greatly improved. In addition, it is necessary to analyze and analyze the biological characteristics of tumor tissues. The development of techniques for analyzing circulating cell free DNA(ccfDNA) in spinal fluid and tissue samples has led to the development of very small amounts of ccfDNA in spinal fluid. The analysis of ccfDNA in the spinal fluid of the patient was conducted in vitro. In the present study, 5 cases of lumbar puncture were performed with ccfDNA extraction and refinement. IDH1, H3F3A gene diversity is analyzed by high resolution melting (HRM), TERT gene diversity is analyzed by droplet digital PCR, MGMT gene diversity is analyzed by HRM. ccfDNA is analyzed by GenomiPhi kit with 500-fold amplification and the same assay. 2 out of 5 cases of GenomiPhi kit increase in amplitude, all cases of GenomiPhi kit increase in amplitude, Low temperature, low temperature, low