EVI1によるPDGFRβ転写制御とグリオブラストーマ血管新生機構について

EVI1对PDGFRβ的转录调控和胶质母细胞瘤血管生成机制

• 批准号: 22K09237
• 负责人: 水口 麻子
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: University of Miyazaki
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2027-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K09237/
• 关键词: EVI1; PDGFRｂ; 血管新生; TKR; 受容体型チロシンキナーゼ; 悪性神経膠腫

①グリオブラストーマ培養細胞株（A172、KS1、LN18、LN229、T98G、U87MG、U251MG、YKG1）を用いて、それぞれの培養細胞を同一条件で培養し、継代して96時間後に回収を行った。その後、それぞれの培養細胞からmRNAを抽出してcDNAを作成し、リアルタイムPCR によりEVI1、EGFR、PDGFRｂ、VEGFR1、VEGFR2、Notch1、AGGF1のmRNA量を比較した。この実験結果を参考に、②以降の実験で用いる培養細胞株を選定した。②複数のグリオブラストーマ培養細胞株に対し、継代後2日目（コンフルエンシーは約3-4割）にリポフェクション法によりsiRNAのトランスフェクションを行い、EVI1をノックダウンした。この時、実験の精度をあげるため、siRNA試薬は2種類（ニッポンジーン社製およびThermosientific社製）使用した。トランスフェクション後は約6時間で培地交換を行い、さらに72時間の培養を行った後に細胞を回収し、PDGFRｂ、VEGFR1の発現変動解析を実施した。この実験結果から、EVI1のノックダウンに伴い、PDGFRbおよびVEGFR1のmRNAおよびprotein発現量が低下する傾向を示す事を確認した。③PEGFRｂおよびVEGFR1のプロモーター領域を組み込んだプロモーターベクターを新たに作成した。既に所属研究室で保有していたEVI1強制発現ベクターと共に、グリオブラストーマ培養細胞株にコトランスフェクションし、48～72時間後に細胞回収した後、デュアルルシフェラーゼアッセイを実施した。この実験結果では、EVI1の強制発現に伴いPDGFRbおよびVEGFR1のプロモーター活性の上昇を認めた。

The cultured cell lines (A172, KS1, LN18, LN229, T98G, U87MG, U251MG, YKG1) were cultured under the same conditions and returned to normal after 96 hours of culture. mRNA was extracted from cultured cells, cDNA was generated, and mRNA levels of EVI1, EGFR, PDGFRb, VEGFR1, VEGFR2, Notch1 and AGGF1 were compared. The results of this study were referenced, and the cultured cell lines were selected. (2) The number of siRNAs in culture cell line was determined by PCR and EVI1. At this time, the accuracy of the test is not guaranteed. There are two types of siRNA drugs used (manufactured by Nikiponen Jinjin Co., Ltd. and Thermosientific Co., Ltd.). After about 6 hours of culture and 72 hours of culture, the expression of PDGFRb and VEGFR1 was analyzed. The results of this study confirm that there is a tendency for EVI1 mRNA and protein expression to decrease. 3. PEGFRb and VEGFR1 are the new domain names. In addition, EVI1 stress was observed in the laboratory. After 48~72 hours, the cells were recovered. The results showed that the stress response of EVI1 was accompanied by an increase in PDGFRb and VEGFR1 activity.