EVI1によるPDGFRβ転写制御とグリオブラストーマ血管新生機構について

EVI1对PDGFRβ的转录调控和胶质母细胞瘤血管生成机制

基本信息

批准号：
22K09237
负责人：
水口麻子
金额：
$ 2.5万
依托单位：
University of Miyazaki
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2027-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K09237/
关键词：
EVI1 PDGFRｂ血管新生 TKR 受容体型チロシンキナーゼ悪性神経膠腫

项目摘要

①グリオブラストーマ培養細胞株（A172、KS1、LN18、LN229、T98G、U87MG、U251MG、YKG1）を用いて、それぞれの培養細胞を同一条件で培養し、継代して96時間後に回収を行った。その後、それぞれの培養細胞からmRNAを抽出してcDNAを作成し、リアルタイムPCR によりEVI1、EGFR、PDGFRｂ、VEGFR1、VEGFR2、Notch1、AGGF1のmRNA量を比較した。この実験結果を参考に、②以降の実験で用いる培養細胞株を選定した。②複数のグリオブラストーマ培養細胞株に対し、継代後2日目（コンフルエンシーは約3-4割）にリポフェクション法によりsiRNAのトランスフェクションを行い、EVI1をノックダウンした。この時、実験の精度をあげるため、siRNA試薬は2種類（ニッポンジーン社製およびThermosientific社製）使用した。トランスフェクション後は約6時間で培地交換を行い、さらに72時間の培養を行った後に細胞を回収し、PDGFRｂ、VEGFR1の発現変動解析を実施した。この実験結果から、EVI1のノックダウンに伴い、PDGFRbおよびVEGFR1のmRNAおよびprotein発現量が低下する傾向を示す事を確認した。③PEGFRｂおよびVEGFR1のプロモーター領域を組み込んだプロモーターベクターを新たに作成した。既に所属研究室で保有していたEVI1強制発現ベクターと共に、グリオブラストーマ培養細胞株にコトランスフェクションし、48～72時間後に細胞回収した後、デュアルルシフェラーゼアッセイを実施した。この実験結果では、EVI1の強制発現に伴いPDGFRbおよびVEGFR1のプロモーター活性の上昇を認めた。

1）使用胶质母细胞瘤培养细胞系（A172，KS1，LN18，LN18，LN229，T98G，U87MG，U251MG，YKG1）在相同条件下培养每个培养的细胞，并在相同的条件下培养细胞，并在通过96小时后培养。之后，将mRNA从每个培养的细胞中提取以产生cDNA，并通过实时PCR比较EVI1，EGFR，PDGFRB，VEGFR1，VEGFR2，NOTCH1和AGGF1的mRNA量。根据该实验的结果，选择了在②实验中使用的培养细胞系。 2）通过LiPofection在通过后第二天用siRNA转染多个培养的胶质母细胞瘤细胞系（约为汇合的30-40％），然后将EVI1击倒。目前，使用两种类型的siRNA试剂（由Nippon Gene和Thermosigrientific制造）来提高实验的准确性。转染后，更改培养基约6小时，在进一步培养72小时后，收获细胞，并进行了PDGFRB和VEGFR1表达变异分析。该实验结果表明，PDGFRB和VEGFR1的mRNA和蛋白质表达水平往往随EVI1敲低而降低。 ③创建了一个新的启动子向量，并结合了PEGFRB和VEGFR1的启动子区域。用已经在实验室中携带的EVI1强制表达载体共转染了细胞，胶质母细胞瘤培养的细胞系，在收获48-72小时后，将细胞收获，然后对细胞进行双荧光素酶测定。在这个实验结果中，随着EVI1的强制表达，PDGFRB和VEGFR1的启动子活性增加。