EVI1によるPDGFRβ転写制御とグリオブラストーマ血管新生機構について

①グリオブラストーマ培養細胞株（A172、KS1、LN18、LN229、T98G、U87MG、U251MG、YKG1）を用いて、それぞれの培養細胞を同一条件で培養し、継代して96時間後に回収を行った。その後、それぞれの培養細胞からmRNAを抽出してcDNAを作成し、リアルタイムPCR によりEVI1、EGFR、PDGFRｂ、VEGFR1、VEGFR2、Notch1、AGGF1のmRNA量を比較した。この実験結果を参考に、②以降の実験で用いる培養細胞株を選定した。②複数のグリオブラストーマ培養細胞株に対し、継代後2日目（コンフルエンシーは約3-4割）にリポフェクション法によりsiRNAのトランスフェクションを行い、EVI1をノックダウンした。この時、実験の精度をあげるため、siRNA試薬は2種類（ニッポンジーン社製およびThermosientific社製）使用した。トランスフェクション後は約6時間で培地交換を行い、さらに72時間の培養を行った後に細胞を回収し、PDGFRｂ、VEGFR1の発現変動解析を実施した。この実験結果から、EVI1のノックダウンに伴い、PDGFRbおよびVEGFR1のmRNAおよびprotein発現量が低下する傾向を示す事を確認した。③PEGFRｂおよびVEGFR1のプロモーター領域を組み込んだプロモーターベクターを新たに作成した。既に所属研究室で保有していたEVI1強制発現ベクターと共に、グリオブラストーマ培養細胞株にコトランスフェクションし、48～72時間後に細胞回収した後、デュアルルシフェラーゼアッセイを実施した。この実験結果では、EVI1の強制発現に伴いPDGFRbおよびVEGFR1のプロモーター活性の上昇を認めた。

①グリオブラストーマ培養細胞株（A172、KS1、LN18、LN229、T98G、U87MG、U251MG、YKG1）を用いて、それぞれの培養細胞を同一条件で培養し、継代して96時間後に回収を行った。その後、それぞれの培養細胞からmRNAを抽出してcDNAを作成し、リアルタイムPCR によりEVI1、EGFR、PDGFRｂ、VEGFR1、VEGFR2、Notch1、AGGF1のmRNA量を比較した。この実験結果を参考に、②以降の実験で用いる培養細胞株を選定した。②複数のグリオブラストーマ培養細胞株に対し、継代後2日目（コンフルエンシーは約3-4割）にリポフェクション法によりsiRNAのトランスフェクションを行い、EVI1をノックダウンした。この時、実験の精度をあげるため、siRNA試薬は2種類（ニッポンジーン社製およびThermosientific社製）使用した。トランスフェクション後は約6時間で培地交換を行い、さらに72時間の培養を行った後に細胞を回収し、PDGFRｂ、VEGFR1の発現変動解析を実施した。この実験結果から、EVI1のノックダウンに伴い、PDGFRbおよびVEGFR1のmRNAおよびprotein発現量が低下する傾向を示す事を確認した。③PEGFRｂおよびVEGFR1のプロモーター領域を組み込んだプロモーターベクターを新たに作成した。既に所属研究室で保有していたEVI1強制発現ベクターと共に、グリオブラストーマ培養細胞株にコトランスフェクションし、48～72時間後に細胞回収した後、デュアルルシフェラーゼアッセイを実施した。この実験結果では、EVI1の強制発現に伴いPDGFRbおよびVEGFR1のプロモーター活性の上昇を認めた。