新規メカノストレス因子による筋疾患への治療介入およびQOL維持への貢献

マウスAIPIDは膜貫通部位１か所の2型膜タンパク質である。生化学的解析を進める中で、細胞外領域であるC末の欠損変異体を発現させると、ミオシンATPaseであるMYK-461処理をして拍動停止した心筋細胞でもSTAT3のリン酸化がみられ、恒常活性化型の変異体であることを見出した（→C-del）。予備的な検討として、心臓以外に骨格筋組織でAIPIDの発現が特異的にみられること、および骨格筋をさらにみると、神経筋接合部(Neuro-Muscular junction: NMJ)へ特異的な局在を示すことを明らかにしてきた。そこで初年度は、上記のC-del、WT、およびGFP（Mock）をAAVウイルスベクターで発現する系を構築し、それそれを8週齢マウスにおける下肢の前脛骨筋（TA）に、～5 × 109 viral genome/マウスの濃度で、50 uLを局所導入した。その後、８週間経過観察した後、骨格筋組織（TA）を回収を行った。その結果、まず、明らかな異常は見られなかった。続いて、回収した組織よりタンパク質を抽出し、Western blot法により、それぞれのAAV導入個体における導入遺伝子の発現評価を行った。その結果、どの群においても安定に発現していることを確認した。さらに、一部については凍結切片を作製したので、まずAIPIDの免疫染色を行った。その結果、NMJの筋肉側のマーカーであるαブンガロトキシンと共局在することが示された。続いて、ヘマトキシリン・エオジン染色により組織の形態を評価すると、WTとC-delにおうて“空胞”が見られた。そこで、Gomoriトリクローム染色を行うと先ほどの空胞部分は、赤紫で染色された構造体が観察される結果となった。

マウスAIPIDは膜貫通部位１か所の2型膜タンパク質である。生化学的解析を進める中で、細胞外領域であるC末の欠損変異体を発現させると、ミオシンATPaseであるMYK-461処理をして拍動停止した心筋細胞でもSTAT3のリン酸化がみられ、恒常活性化型の変異体であることを見出した（→C-del）。予備的な検討として、心臓以外に骨格筋組織でAIPIDの発現が特異的にみられること、および骨格筋をさらにみると、神経筋接合部(Neuro-Muscular junction: NMJ)へ特異的な局在を示すことを明らかにしてきた。そこで初年度は、上記のC-del、WT、およびGFP（Mock）をAAVウイルスベクターで発現する系を構築し、それそれを8週齢マウスにおける下肢の前脛骨筋（TA）に、～5 × 109 viral genome/マウスの濃度で、50 uLを局所導入した。その後、８週間経過観察した後、骨格筋組織（TA）を回収を行った。その結果、まず、明らかな異常は見られなかった。続いて、回収した組織よりタンパク質を抽出し、Western blot法により、それぞれのAAV導入個体における導入遺伝子の発現評価を行った。その結果、どの群においても安定に発現していることを確認した。さらに、一部については凍結切片を作製したので、まずAIPIDの免疫染色を行った。その結果、NMJの筋肉側のマーカーであるαブンガロトキシンと共局在することが示された。続いて、ヘマトキシリン・エオジン染色により組織の形態を評価すると、WTとC-delにおうて“空胞”が見られた。そこで、Gomoriトリクローム染色を行うと先ほどの空胞部分は、赤紫で染色された構造体が観察される結果となった。