正常子宮内膜上皮幹細胞におけるde novo遺伝子変異の発癌における意義

正常子宫内膜上皮干细胞基因从头突变在癌变中的意义

基本信息

批准号：
22K09572
负责人：
佐藤誠也
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Shimane University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

正常子宮内膜単一腺管および単一腺管由来スフェロイドにおけるKRAS/PIK3CA変異の有無を以下の手順で検索した。①外科的に切除した子宮 (n = 3)の内膜を肉眼的に9つの領域に分割し、各領域から40個の単一腺管を鏡視下に単離した。②各領域の10個の単一腺管（計270個）からDNAを抽出し、サンガーシーケンスを実施した。③残りの30個の腺管を子宮内膜の領域毎に長期の幹細胞培養へ供し、直径5mm以上へ発育したスフェロイドを回収して同様に遺伝子解析を行った。遺伝子変異を有する単一腺管内の変異対立遺伝子頻度 (MAF)をdroplet digital PCRにより算出し、スフェロイドの性質を上皮マーカー（PAX8）と幹細胞マーカー（核Axin2/SOX9、細胞質ALDH1A1）を用いた免疫組織化学で評価した。サンガー法により子宮内膜単一腺管のKRASまたはPIK3CAのホットスポットにおける遺伝子変異の検出が可能であった。回収した腺管の9.3%（25/270）にKRASまたはPIK3CAの変異を認め、各子宮内膜領域の変異頻度は 0～50%と領域性を示した。単一腺管内のPIK3CA変異のMAFは16.4%と高く、腺内での変異細胞のクローン増殖が示された。収集したスフェロイドは主にPAX8および幹細胞マーカー発現細胞で構成され、その60%以上にPIK3CA変異を認めたもののKRAS変異は検出されなかった。子宮内膜単一腺管内におけるPIK3CA変異の高いMAF、および単一腺管に由来する幹細胞リッチなスフェロイドにおける頻繁なPIK3CA変異は、子宮内膜上皮幹細胞の増殖におけるPIK3CA変異の重要性を示唆した（Cancer Sci. 2023）。

使用以下程序搜索了从单管衍生的正常子宫内膜单管和球体中的KRAS/PIK3CA突变的存在或不存在。 1）在视觉上将手术切除的子宫衬里（n = 3）分为9个区域，在视觉上在视觉上分离了40个单腺管。 2）从每个区域的10个单管中提取DNA（总计270个），并进行了Sanger测序。 ③其余30个腺管对每个子宫内膜区域进行了长期的干细胞培养，并收集了直径为5 mm或更多的球体，并以相同的方式进行了遗传分析。通过液滴数字PCR计算单个管道中的突变等位基因频率（MAF），并使用上皮细胞标记（PAX8）和干细胞标记（核AXIN2/SOX9，细胞质ALDH1A1）通过免疫组织化学评估球体的特性。 Sanger方法允许在单个子宫内膜管中检测KRAS或PIK3CA热点中的基因突变。在收集到的腺管的9.3％（25/270）中观察到KRAS或PIK3CA中的突变，每个子宫内膜区域的突变频率为0-50％，表明区域性质。单个管道内的PIK3CA突变的MAF在16.4％的高度为16.4％，表明腺体内突变细胞的克隆生长。收集的球体主要由表达PAX8和干细胞标记的细胞组成，尽管在其中60％以上的其中观察到了PIK3CA突变，但未检测到KRAS突变。在单个子宫内膜导管中的PIK3CA突变的高MAF和源自干细胞富的球体中的PIK3CA突变频繁的PIK3CA突变表明，PIK3CA突变在子宫内膜上皮干细胞增殖中的重要性（癌症Sci。2023）。