アデノ随伴ウィルスベクターを用いた網膜再生能の賦活化

使用腺相关病毒载体激活视网膜再生能力

• 批准号: 22K09778
• 负责人: 齋藤 文典
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tokyo Women's Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K09778/
• 关键词: アデノ随伴ウィルス; 網膜; ミュラー細胞; AAV

本研究は、哺乳類の網膜ミュラー細胞の脱分化および増殖を促進する因子をミュラー細胞に過剰発現することにより、傷害網膜の再生を賦活化することを目的としている。申請者らは、これまでにアルキル化剤であるMNUを投与した網膜傷害モデル動物を用いて網膜傷害後にマウスのミュラー細胞は全く増殖しないこと、ラットでは多くのミュラー細胞が増殖するが、DNA損傷を起こして、網膜再生前に死滅することを報告した。また、傷害網膜における両動物間の遺伝子の比較解析を行い、脱分化および増殖を促進するに関与する候補因子を同定した。本年度はGFAPプロモーターの下で目的遺伝子を発現するAAVベクターを作製した。AAVのパッケージングにはミュラー細胞と親和性が高いshH10を用いた。はじめに、マウス網膜のミュラー細胞への遺伝子導入の特異性および効率をEGFPを発現するAAVを用いて詳細に解析した。EGFPを発現するAAV (～1 x 10^12 vg/μl)を3週令のマウス硝子体内に2μl注入して、2週間後に解析を行った。EGFPとミュラー細胞マーカーであるGSとの免疫染色の結果、傷害を誘導していない網膜でミュラー細胞に特異的なEGFPの発現を確認した。また、MNUの投与により網膜傷害を誘導したミュラー細胞においてもEGFPが特異的に発現することも確認した。増殖を促進する因子を導入したマウスを作製し網膜傷害を誘導した結果、多くのミュラー細胞が細胞周期に進入することが明らかになった。コントロールとして用いたEGFPを発現するマウスでは、AAV非感染のマウスと同様に細胞周期に進入するミュラー細胞は見られなかった。これらの結果から、哺乳類の網膜においても、ミュラー細胞の脱分化・増殖に不足している因子を導入すること導入することで、網膜再生能が賦活化される可能性が示唆された。

The aim of this study is to promote the development of dedifferentiation and proliferation factors in mammalian retina cells and to activate regeneration of injured retina cells. The applicant shall report the complete cell proliferation after MNU administration and retinal injury in animals, the initiation of DNA damage, and the death before retinal regeneration. Comparative analysis of genes between animals in the retina, injury, and reproduction were identified as candidate factors. This year, the GFAP has launched an AAV program to control the development of target genes. AAVs have a high affinity for cells. A detailed analysis of the specificity and efficiency of EGFP gene expression in the retina. EGFP was detected by AAV (~1 x 10^12 vg/μ l), and 2 μ l was injected into EGFP and analyzed after 2 weeks. EGFP cells were identified by immunostaining, injury induction, and EGFP cell specific expression. The expression of EGFP in cells was confirmed by MNU. The cell cycle is regulated by the gene AAV is not infected with EGFP, but it is infected with EGFP and enters the cell cycle. These results suggest the possibility of introducing factors into mammalian retinas that may be responsible for the dedifferentiation and proliferation of mammalian retinas.