LIMK2に注目した、肥厚性瘢痕・ケロイドのコントロール

以 LIMK2 为重点控制肥厚性疤痕和疤痕疙瘩

• 批准号: 22K09881
• 负责人: 黒田 一也
• 金额: $ 2万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K09881/
• 关键词: LIMK2; アポトーシス; RhoA; ケロイド; 肥厚性瘢痕

①活性型および不活性型LIM kinase2を発現するアデノ随伴ウイルスベクターの作成遺伝子導入のための２型アデノ随伴ウイルスベクターを作成するために、pAAV-CMV-LIMK2-GFPベクターを購入した。pAAV-CMV-LIMK2-GFPベクターのLIMK2の505番目の塩基Threonine (ACG)を PCR法を用いてGlutamic AcidおよびValine に変異させ、LIM kinase2の活性型および不活性型(それぞれGFP tag付き)を発現するベクターを構築した。TAKARA AAV purification kit を用いてLIMK2のconstitutive activeおよびdominant negativeを発現する２型アデノ随伴ウイルスベクターを作成した。コントロールとして、GFPのみを発現するAAV２ベクターを作成した。②LIM kinase2の活性型を導入した際の伸展刺激に対する反応正常線維芽細胞に活性型LIMK2およびコントロールとしてGFPの遺伝子導入を行い、伸展刺激を加えた。ウエスタンブロッティングでリン酸化cofilinおよびαSMAの発現を確認した。正常線維芽細胞およびAAV2-GFP導入線維芽細胞では、伸展刺激を加えていない群と比較して、加えた群でリン酸化cofilinおよびαSMAの発現は上昇を認めた。一方はAAV2-LIMK2-mutant-GFP導入線維芽細胞では伸展刺激を加えても、加えていない群と比較して リン酸化cofilinおよびαSMAの発現は同程度であった。このことから、LIMK2が通常でリン酸化が亢進している場合、伸展刺激に対しそれ以上のリン酸化促進が認められず、筋線維芽細胞への分化促進が起こりにくいと考えられ、線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化をコントロールできる可能性が示唆された。

1）创建与表达活跃和非活性的LIM Kinase2的腺相关病毒载体，以生成2型腺相关病毒载体进行基因转移，购买了PAAV-CMV-LIMK2-GFP载体。使用PCR将PAAV-CMV-LIMK2-GFP载体（ACG）的Limk2的第505个碱基苏氨酸（ACG）突变为谷氨酸和valine，以构建表达Lim Kinase2的活性和无效形式的向量（分别具有GFP TAG）。使用Takara AAV纯化试剂盒制备了2型腺相关的病毒载体表达limk2构成活性和显性阴性的。作为对照，仅生成了单独表达GFP的AAV2矢量。 2）将LIM Kinase2的活性形式引入时对延伸刺激的反应被转移到正常的成纤维细胞和GFP中作为对照，并应用了延伸刺激。 Western印迹证实了磷酸化的Cofilin和αSMA的表达。在正常的成纤维细胞和AAV2-GFP转染的成纤维细胞中，与未受到延伸刺激的组相比，该组中磷酸化的Cofilin和αSMA的表达增加。另一方面，即使在AAV2-LIMK2-MUTANT-GFP转染的成纤维细胞中施加刺激时，与未应用的组相比，磷酸化的Cofilin和αSMA的表达也相似。这表明，当limk2正常并且磷酸化增加时，未观察到响应延伸刺激的进一步促进磷酸化，并且不可能促进分化为肌纤维细胞的分化，这表明可以控制与成纤维细胞从成纤维细胞区分到肌成纤维细胞。