ARONJ治療に用いるMSC由来エクソソームの責任因子および作用機序の同定

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C57/BL6マウスの腹部から脂肪を採取し、酵素処理によって間葉系幹細胞を単離した。単離した細胞をウシ胎児血清添加培地で第３継代まで培養し凍結保存した細胞を本研究に使用した。間葉系幹細胞をウシ胎児血清添加培地で70～80%コンフルエントまで培養後、リン酸緩衝液で洗浄し、無血清培地に交換して24時間培養後に培養上清を回収した。この培養上清を密度勾配遠心法で5つのフラクションに分画し、各フラクションに含まれる小型細胞外小胞(small extracellular vesicles, sEVs)を超遠心法で分離精製した。得られたsEVsはInternational Society for Extracellular Vesiclesのガイドラインに適合するsEVsであることを確認するため、電子顕微鏡によるサイズ、形態、コンタミネーションの確認。ウエスタンブロット法による各種マーカー発現(CD9、CD63、CD81、ALIX、HSP70、HSP90)の確認、ミトコンドリアなどの蛋白夾雑物混入の有無を評価する予定である。MSC-sEVs各サブタイプのビスホスホネートによる細胞障害に対する保護作用を検討するため、C57/BL6マウスから採取した骨芽細胞、線維芽細胞をゾレドロン酸存在下、およびゾレドロン酸＋MSC-sEVs存在下で培養した。そしてゾレドロン酸による細胞障害作用（ベータガラクトシターゼ陽性細胞の出現頻度、老化関連因子p21、pRBの発現、スクラッチテストによる細胞遊走能の低減など）を指標としてMSC-sEVsの細胞保護作用をサブタイプごとに評価する実験系を立ち上げている。sEVsの効果を検証するために使用する薬剤性顎骨壊死モデルマウス作製時の発症率の向上を目指し、絹糸によるリガチャーの追加、局所へのエンドトキシンの投与により発症率が向上するか検討をおこなっている。