歯肉退縮の新規治療を目指した創傷治癒性マクロファージの解析

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まず、比較的作製が容易なマウス皮膚創傷モデルを作製した。全身麻酔下に、C57BL6/Jマウス（雄：6-8週齢）の背部を除毛し、生研パンチ（径6mm）を用いて背部両側に皮膚全層欠損を作製した。次に、創の収縮を防止するために、約8mm径のOリングを創部周囲に縫着した。その後、防水保護シールを貼って創部の乾燥を防止した。このようにして作製したマウスモデルにおいて、創の治癒を経時的に肉眼観察した。その後、マウスを安楽死させた後、創があった部分を含む皮膚を切除して回収し、ホルマリン固定、パラフィン包埋を行い、薄切して組織切片を作製した。切片をヘマトキシリン＆エオジンで染色し、創部の両端の距離や、肉芽組織形成の程度、マクロファージを含む炎症細胞浸潤の程度などを評価した。また、投与するマクロファージの調製については、骨髄細胞由来および脾臓細胞由来のものについて比較検討した。また、ヒアルロン酸濃度依存的にM2d様の性質を持つようになることを、リアルタイムPCRでVEGFの発現が上昇し、TNFαの発現が低下すること、貪食能アッセイでの貪食能亢進や、トランスウェルアッセイで血管内皮細胞の遊走能が亢進することなどで再確認した。これを踏まえて、骨髄細胞をM-CSF存在下で１週間培養し、得られた骨髄由来マクロファージを、ヒアルロン酸6.7mg/mLを含む培地を用いてさらに1週間培養したものを、上記モデルの創1か所あたり2.5-5.0×10^5細胞投与した群も設定し、検討を開始した。