TGF-βによるヒト造血細胞株の分化誘導と細胞周期調節に関する研究

TGF-β对人造血细胞系分化诱导及细胞周期调控的研究

基本信息

批准号：
08877165
负责人：
目黒邦昭
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至 1997
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08877165/
关键词：
赤芽球分化 TGF-β CDK inhibitor

项目摘要

本研究の目的は造血細胞株の細胞周期調節におけるTGF-βの作用の解析をつうじて、造血幹細胞の細胞周期調節機構を理解し、ひいては造血幹細胞の臨床応用を行うための基礎知識を提供することである。まず始めに、赤芽球系細胞株YN-1細胞をTGF-βで赤芽球系分化誘導し、造血細胞株におけるTGF-βの細胞周期調節関連遺伝子発現に及ぼす作用を解析した。方法:YN-1細胞をTGF-βで処理し、赤芽球系分化誘導した際の、細胞周期関連因子の発現をNorthern blot,RT-PCR,Western blot法を用い解析した。結果:YN-1細胞はTGF-β処理後細胞増殖が抑制されたが、明らかな細胞周期停止には至らなかった。この時、赤芽球系形質としてδ-aminolevulinate synthase,α-globinおよびβ-globinの発現の誘導ををNorthern blot法およびRT-PCR法で確認した。細胞周期関連因子の発現について検討した。Western blot法を用い検討を行い、pRB、cyclin D,EのTGF-βで分化誘導後6日後を最低値とした減少が認められた。pRBは非リン酸化型の増加が認められた。cdk2,cdk4発現は培養10日目まで明らかな変化は認めなかった。一方、CDK inhibitorのP27はTGF-β処理後2日目より発現が認められ、6日後にピークに達した。p21発現は8日目以降にわずかに認められた。RT-PCRを用いた検討でもp21,p27mRNAの発現誘導が認められた。p15,p16の発現はwestern blot法およびRT-PCR法で検出できなかった。考察:赤芽球系細胞株YN-1をTGF-βで分化誘導すると赤芽球系分化が誘導された。この時、pRBは全体の発現量は減少するが、非リン酸化型は増加した。これとほぼ時期を一致して細胞増殖の抑制が見られ始めている。このpRBのリン酸化を阻害する因子としてCDK inhibitorの誘導が知られているが、YN-1ではp27、ついでわずかにp21の誘導が確認された。特にp27は、赤芽球系形質の誘導とほぼ同じ時期に発現が増加しており、分化誘導にも何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。線維芽細胞をTGF-βで処理したときにp27が誘導されることが知られているが、TGF-βによる赤芽球系細胞分化においてp27発現が誘導されることはこれまで知られていない。今後の課題は、p27の発現が細胞周期停止のみに関わるのか、あるいは分化形質発現にも積極的に関わるのかを検討することである。我々はすでにp27を発現を誘導できる発現ベクターを導入したYN-1細胞株を得ており、今後p27の過剰発現とあるいはanti-sense oligonucleotideなどを用い抑制した場合の赤芽球分化及び細胞周期調節に及ぼす影響を明らかにする予定である。

这项研究的目的是分析TGF-β在造血细胞系的细胞周期调节中的影响，并提供基本知识，以了解造血干细胞的细胞周期调节机制，从而临床应用造血干细胞。首先，我们用TGF-β诱导红细胞细胞系YN-1细胞，并分析了TGF-β对造血细胞系中与细胞周期调节基因表达的影响。方法：当YN-1细胞用TGF-β处理并诱导红细胞分化时，使用Northern印迹，RT-PCR和Western blot方法分析了与细胞周期相关因子的表达。结果：YN-1细胞在TGF-β处理后抑制细胞增殖，但并未导致明显的细胞周期停滞。此时，通过Northern blot和RT-PCR方法证实了δ-氨基乙酸合酶，α-珠蛋白和β-珠蛋白作为红细胞性状的诱导。研究了与细胞周期相关因子的表达。使用蛋白质印迹方法研究结果，并在分化诱导后6天在最低水平观察到PRB，Cyclin d和E的TGF-β降低。观察到非磷酸化形式的PRB增加。直到培养10天，在CDK2和CDK4表达中没有观察到明显的变化。同时，在TGF-β处理后的第二天观察到CDK抑制剂p27的表达，并在6天后达到峰值。第8天后观察到轻微的P21表达。RT-PCR研究还显示了P21和P27 mRNA表达的诱导。 p15和p16的表达无法通过Western印迹和RT-PCR方法检测到。讨论：通过TGF-β诱导红细胞细胞系YN-1的分化诱导的红细胞分化。目前，PRB的总体表达水平降低，但非磷酸化形式增加了。大约在同一时间，细胞增殖开始被抑制。 CDK抑制剂的诱导被称为抑制PRB磷酸化的因素，但在YN-1，P27中，然后证实了P21的略有诱导。特别是，与诱导红细胞性状的诱导同一时间，p27的表达增加了，这表明它也可能在诱导分化中起作用。众所周知，当成纤维细胞用TGF-β处理时会诱导p27，但尚不知道它可以通过TGF-β诱导红细胞细胞分化的P27表达。未来的挑战是研究P27表达是否仅参与细胞周期停滞或积极参与分化性状表达。我们已经获得了YN-1细胞系，该细胞系已引入了能够诱导p27表达的表达载体，我们计划使用反义寡核苷酸和细胞周期调节来阐明p27过表达和抑制的影响。