平滑筋細胞に発現するbHLH遺伝子の検索

平滑筋細胞の分化制御機構解明を目標に、私は平滑筋としての分化形質を有する培養株化細胞の開発に成功した。本研究ではこの細胞を利用して種々の細胞分化調節遺伝子構造の中に共通に見い出されるbHLH配列を有する遺伝子の検索を行った。*成果1bHLH遺伝子検索用プローブの作製2平滑筋の分化形質を有する培養株化細胞を用いてのcDNA遺伝子ライブラリー作製株化細胞からオリゴ(dt)セルロースカラムによるmRNAの調製、mRNAからGubler&Hoffmannの方法に従いcDNAの合成、ラムだgt11ベクターへの連結、パッケージングの過程を経てcDNAライブラリーを作製した。3bHLH遺伝子検索用プローブの標識及びcDNAライブラリーのスクリーニング1で作製したプローブをランダムプライム法を用いて蛍光標識をし、2で作製したライブラリーのファージを大腸菌に感染させ寒天培地上にプラークを形成させた。各々のプラークDNAをニトロセルロース膜へと転写した。標識プローブとハイブリダイゼーションを行った。4目的遺伝子のクローニングとBluescriptベクターへのサブクローニング3で反応が得られたプラークのDNAを用いたサザンプロット法により、bHLH構造を含むことが確認されたクローンのみを用いて同様に二次、三次スクリーニングを行った。そしてクローニングされた各cDNAクローンをBluescriptベクターにサブクローニングした。以上のように平成8年度の本研究でbHLH遺伝子のクローニングに成功した。今後はこの遺伝子の構造、機能の解析を進める。

平滑筋細胞の分化制御機構解明を目標に、私は平滑筋としての分化形質を有する培養株化細胞の開発に成功した。本研究ではこの細胞を利用して種々の細胞分化調節遺伝子構造の中に共通に見い出されるbHLH配列を有する遺伝子の検索を行った。*成果1bHLH遺伝子検索用プローブの作製2平滑筋の分化形質を有する培養株化細胞を用いてのcDNA遺伝子ライブラリー作製株化細胞からオリゴ(dt)セルロースカラムによるmRNAの調製、mRNAからGubler&Hoffmannの方法に従いcDNAの合成、ラムだgt11ベクターへの連結、パッケージングの過程を経てcDNAライブラリーを作製した。3bHLH遺伝子検索用プローブの標識及びcDNAライブラリーのスクリーニング1で作製したプローブをランダムプライム法を用いて蛍光標識をし、2で作製したライブラリーのファージを大腸菌に感染させ寒天培地上にプラークを形成させた。各々のプラークDNAをニトロセルロース膜へと転写した。標識プローブとハイブリダイゼーションを行った。4目的遺伝子のクローニングとBluescriptベクターへのサブクローニング3で反応が得られたプラークのDNAを用いたサザンプロット法により、bHLH構造を含むことが確認されたクローンのみを用いて同様に二次、三次スクリーニングを行った。そしてクローニングされた各cDNAクローンをBluescriptベクターにサブクローニングした。以上のように平成8年度の本研究でbHLH遺伝子のクローニングに成功した。今後はこの遺伝子の構造、機能の解析を進める。